Literatur-Tipp
Automated GC–MS Determination of Δ9 Tetrahydrocannabinol, Cannabinol and Cannabidiol in Hair, S. Heinl, O. Lerch, F. Erdmann, Journal of Analytical Toxicology 40 (2016) 498-503

Zum vollständig automatisierten Nachweis der Cannabis-Metaboliten THC-COOH und THC-OH verwendetes Analysensystem bestehend aus GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS, Dual-Head) und GC-MS/MS-Kombination (7890B/7000B, Agilent Technologies). Der MPS verfügt über unterschiedliche Module für eine umfangreich automatisierte Probenvorbereitung, u. a. beheizbarer Agitator, Waschstation, unterschiedliche Trays für die Proben und SPE-Kartuschen, SPE-Option, Lösemittelstation, Lösemittelreservoir und Multi-Position-Evaporation-Station (mVAP).

Quantifier/Qualifier von THC-COOH (o.) und THC-OH (u.) bei 0,2 pg/mg (LOD) automatisiert extrahiert aus einer dotierten Blindhaarprobe und detektiert mit einem Agilent 7000B Triple Quadrupol MS.
Literatur-Tipp
Determination of THC and its metabolites 11-hydroxy-THC (THC-OH) and 11-nor-9-carboxy-THC (THC-COOH) in blood serum, K. Purschke, S. Heinl, O. Lerch, F. Erdmann, F. Veit, Anal. Bioanal. Chem. 408 (2016) 4379-4388

Analyt
LOQ [pg/mg]
LOD [pg/mg]
THC-COOH 0,5 0,2
THC-OH 0,5 0,2
THC 5 2
CBN 5 2
CBD 5 2

Auszug aus den Validierungsdaten der automatisierten MPS-SPE-GC-MS/MS-Methode zum Nachweis von THC-COOH, THC-OH, THC, CBN und CBD in Haar (gemäß den Vorgaben der GTFCh). Die relative Standardabweichung variierte zwischen 2 und 7 Prozent.

Danksagung
Der Autor dankt Tobias Kieliba und Hilke Andresen-Streichert vom Institut für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Köln sowie Justus Beike (früher Rechtsmedizin Köln, jetzt Rechtsmedizin Münster) für die hervorragende Zusammenarbeit im hier geschilderten Projekt.

Forensisch-toxikologische Routineanalytik

Cannabis-Metaboliten THC-COOH und THC-OH in Haar vollautomatisiert nachweisen

Um Cannabiskonsum anhand einer Haaranalyse belegen zu können, braucht es mehr als die Bestimmung von Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC), Cannabinol (CBN) oder Cannabidiol (CBD), dreier in der Cannabispflanze natürlicherweise vorkommender Cannabinoide. Als hinreichend gilt der Nachweis von 11-nor-9-carboxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-COOH) und 11-Hydroxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-OH). Bei beiden Verbindungen handelt es sich um Metaboliten des Cannabiswirkstoffs Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC). Das Institut für Rechtsmedizin der Universitätsklinik Köln entwickelte in Zusammenarbeit mit GERSTEL eine Analysenmethode und das dazugehörige Analysensystem, mit dem sich der Nachweis von THC-COOH und THC-OH in Haar vollständig automatisieren und, orientiert an den Vorgaben der „Society of Hair Testing“ (SoHT), sicher und effizient durchführen lässt [1].

Von Dr. Oliver Lerch

Ein zentraler Schritt bei der Entwicklung der hier vorgestellten und am Institut für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Köln etablierten Methode zum Nachweis von THC-COOH und THC-OH in der Matrix Haar war die Reduzierung manueller Tätigkeiten, die in aller Regel aufwendig sind und zudem eine Quelle für den Eintrag von Fehlern darstellen. Ausgangspunkt unserer Methodenentwicklung waren in der Literatur beschriebene Vorgehensweisen beim Nachweis von THC-COOH und THC-OH in Haar, unter Berücksichtigung des von der Society of Hair Testing (SoHT) geforderten extrem niedrigen Cut-Off-Wertes für THC-COOH von 0,2 pg/mg: Die GC-MS/MS-Analyse mit negativer chemischer Ionisierung (NCI) nach Derivatisierung mit Perfluoralkyl-Reagenzien spielt eine Rolle wie auch die HPLC-MS/MS(/MS) [2-6]. Wir richteten unser Augenmerk auf die Automatisierung der Probenvorbereitung und die Analyse mittels GC-MS/MS.

Haar ist eine sehr komplexe Matrix. Um darin eingelagerte Wirkstoffrückstände und Stoffwechselprodukte nachweisen zu können, sind Haare zum Beispiel basisch aufzuschließen. Matrixbestandteile sind zu entfernen und die Analyten anzureichern, um die Analyse reproduzierbar, empfindlich und frei von einem Übermaß an Störfaktoren durchführen zu können. Ziel der Zusammenarbeit mit Tobias Kieliba vom Institut für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Köln war es, eine Methode zu entwickeln, die sich idealerweise nicht allein für die Bestimmung von THC-COOH und THC-OH eignet, sondern mit der sich ebenso die ganze Bandbreite der interessanten Cannabiskomponenten in einem Arbeitsgang erfassen lässt, folglich auch THC, CBN und CBD. Weiterhin sollte der in der Routine aufwendige Umbau des MS auf NCI entfallen und die Standard Electron Impact (EI) Ionisierung eingesetzt werden.

Auf die Automatisierung der Probenvorbereitung kommt es an

Natürlicherweise lässt sich in der Probenvorbereitung das meiste Optimierungspotenzial einer Analysenmethode identifizieren und realisieren. Nach einer detaillierten Beschäftigung mit der Anwendung und fundierenden Experimenten gelang es, ein Analysensystem in der forensisch-toxikologischen Laborpraxis des Instituts für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Köln in den Dienst zu stellen, das eine vollständige Automatisierung der Probenvorbereitung und Probenaufgabe im beschriebenen Kontext und Umfang erlaubte. Einzig die Vorbereitung der Haarprobe, also das Waschen mit Dichlormethan, Trocknen und Mahlen sowie die Vorlage der gemahlenen Proben in Vials und deren Positionierung auf Probentrays, werden von Hand ausgeführt. Alle weiteren Schritte verlaufen vollständig automatisiert auf einer Dual-Head-Version des GERSTEL-MultiPurposeSamplers (MPS), der online an das verwendete GC-MS/MS-System (GC 7890B/7000B Triple Quadrupol MS, Agilent Technologies)gekoppelt ist: Der MPS dosiert auf Wunsch den internen Standard zur Probe (im vorliegenden Fall deuterierte Analoga der Analyten) sowie eine 1 M Lösung von Natriumhydroxid (NaOH), um die Haarmatrix aufzuschließen und die Analyten freizusetzen. Unmittelbar im Anschluss unterzieht der MPS die Probe zwecks Aufreinigung und Anreicherung der Analyten einer Festphasenextraktion (SPE) über eine zeitnah mit Methanol und Wasser konditionierte SPE-Kartusche, gefüllt mit einem Anionentauscher-Material (HR-XA, Macherey-Nagel). Nach jeweils einem Waschschritt mit Wasser und Acetonitril wurde das Sorbens mit Argon getrocknet. Dem schloss sich die Elution der Analyten mit einem Lösemittelgemisch bestehend aus Isohexan, Ethylacetat und Essigsäure an. Der Extrakt wurde vom MPS aufgefangen, mittels mVAP eingedampft, in MSTFA aufgenommen und dann in den GC injiziert. Die Derivatisierung der Analyten erfolgte im heißen Split/Splitlos-Injektor, die Detektion mittels eines Agilent 7000B Triple-Quadrupol-MS nach Electron Impact Ionisierung (EI) im Modus Multi-Reaction-Monitoring (MRM).

Automatisierung der Bestimmung von THC-COOH und THC-OH gelungen

Die Automatisierung der hier beschriebenen Methode zur Bestimmung von Cannabis-Metaboliten in Haar erbrachte eine erhebliche Einsparung der sonst üblichen manuellen Arbeitsschritte, was mit einer Reduzierung potenzieller Fehlerquellen einhergeht. Ganz wesentlich ist aus unserer Sicht festzustellen, dass bestimmte „Kunstgriffe“, die manuell eher unüblich sind – unter anderem die Durchführung einer fraktionierten Elution mit definierter Flussgeschwindigkeit, um eventuell noch im Extrakt vorhandene Matrixbestandteile vor der Analyse zu entfernen –, zu einer Verbesserung der Analysenresultate geführt haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, alle eingangs beschriebenen Zielanalyten lassen sich in Haar in den relevanten Konzentrationen (sub-pg/mg für THC-COOH und THC-OH) nachweisen, und zwar mit nur einer Methode in einem Analysenlauf. Sie wurde gemäß den Richtlinien der GTFCh auf Herz und Nieren geprüft und validiert. Mit dem verwendeten Agilent 7000B-QQQ-MS im EI-Modus wurde der von der Society of Hair Testing für THC-COOH geforderte Cut-Off-Wert von 0,2 pg/mg (als Nachweisgrenze) erreicht. Die Standardabweichung (RSD) lag für alle Zielanalyten im Bereich von 2 bis 7 Prozent, was sich als überaus zufriedenstellend erweist.

Quellen

[1] GERSTEL-Poster-Präsentation, TIAFT 2016, Brisbane, Australien
[2] C. Moore, S. Rana, C. Coulter, F. Feyerherm, H. Prest, Journal of Analytical Toxicology 30 (2006) 171-177
[3] M. A. Huestis, R. A. Gustafson, E. T. Moolchan, A. Barnes, J. A. Bourland et al., Forensic Science International 169 (2007) 129-136
[4] E. Han, Y. Park, E. Kim, S. In, W. Yang et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 55 (2011) 1096-1103
[5] S. Dulaurent, J. M. Gaulier, L. Imbert, A. Morla, G. Lachatre, Forensic Science International 236 (2014) 151-156
[6] D. Thieme, U. Sachs, H. Sachs, C. Moore, Drug Testing and Analysis 7 (2015) 577-585

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