MPS-GC/MS-Komplettsystem zum automatisierten Nachweis von THC, CBN und CBD aus der Matrix Haar.

Optimale Phasentrennung: Extraktphase (oben) und aufgelöste Haare (unten) nach vollständig automatisierter Probenvorbereitung mit dem GERSTEL-MPS-GC/MS-Komplettsystem.

Die Extraktion von THC, CBN und CBD aus Haar erfolgt im Rahmen der GERSTEL-Methode automatisiert und beschleunigt im quickMIX-Modul des MPS.
Danksagung

Der Autor dankt Frau Sonja Heinl sowie Herrn Dr. Freidoon Erdmann vom Institut für Rechtsmedizin der Universität Gießen für die gute und erfolgreiche Zusammenarbeit bei der Entwicklung der hier vorgestellten Methode.

Forensische Toxikologie

THC an den Haaren herbeigezogen

Im Rahmen eines Gemeinschaftsprojekts des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Gießen und GERSTEL wurde das Forschungsvorhaben erfolgreich umgesetzt, den bislang manuell erfolgenden Nachweis des Cannabiswirkstoffs Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) sowie der Cannabinoide Cannabinol (CBN) und Cannabidiol (CBD) in Haaren vollständig zu automatisieren.

Von Oliver Lerch,
GERSTEL GmbH & Co. KG, Mülheim an der Ruhr

Aus forensisch-toxikologischer Sicht erweist sich die Matrix Haar als gut geeignet, um einen zurückliegenden oder länger währenden Medikamenten- oder Drogenkonsum ergebnishaft zu dokumentieren. Der Grund ist physiologischer Natur: Ein menschliches Kopfhaar wächst täglich zwischen 0,25 und 0,4 Millimetern [1], also zwischen 7,5 und zwölf Millimetern im Monat. Während der Haarbildung werden im Blut, Sebum oder Schweiß vorhandene Drogen- und Medikamentenwirkstoffe sowie deren Abbauprodukte ins Haar aufgenommen und dort abgelagert. Bei einem einmaligen beziehungsweise kurzzeitigen Drogenkonsum verändert dieses „Wirkstoffdepot“ seine Lage mit der Haarlänge; es wächst sich sozusagen aus und ist spätestens dann nicht mehr nachweisbar, wenn der Friseur seine Arbeit erledigt und den „Beweis“ entsorgt hat. Mit anderen Worten lässt sich an einem Haar ablesen, ob Drogen über einen längeren Zeitraum konsumiert wurden und von welcher Art die Drogen waren. Eine Haaranalyse kann somit auch einen Beleg für eine längere Drogenabstinenz liefern.

Cannabiskonsum nach dem Scherenschnitt nachweisen

Die Bestimmung eines zurückliegenden oder längerfristigen Cannabiskonsums in Haaren ist aufwendig, da die gespeicherten Wirkstoffrückstände zunächst aus der Matrix freigesetzt und in eine analysierbare Form überführt werden müssen; vorher ist an eine GC/MS-Bestimmung relevanter Analyten nicht zu denken. Am Institut für Rechtsmedizin der Universität Gießen wurde die für den Nachweis des Cannabiswirkstoffs Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) sowie der Cannabinoide Cannabinol (CBN) und Cannabidiol (CBD) aus Haaren erforderliche Probenvorbereitung von Hand ausgeführt. Ziel der Zusammenarbeit des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Gießen und GERSTEL war es, den bisherigen Analysenprozess auf sein Automatisierungspotenzial zu prüfen und möglichst komplett auf ein GC/MS-System mit integrierter automatisierter Probenvorbereitung und Probenaufgabe zu übertragen.

Manuelle Vorgehensweise liefert Aufschluss

Ob sich eine bestehende manuelle Analysenmethode unter Beibehaltung aller Analysenparameter automatisieren lässt, setzt eine eingehende Prüfung und Bewertung der manuellen Vorgehensweise voraus.

Am Institut für Rechtsmedizin der Universität Gießen wurden Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) sowie die Cannabinoide Cannabinol (CBN) und Cannabidiol (CBD) wie folgt in Haaren nachgewiesen: Die Haarproben wurden mit Hexan und Aceton gewaschen, getrocknet und gemahlen; 100 mg der gemahlenen Haarprobe wurden entnommen und mit internem Standard versetzt. Der Aufschluss der Haare erfolgte mit einmolarer Natronlauge (NaOH) für die Dauer von 15 Minuten bei 80 °C. Mittels zweimaliger Flüssig-Flüssig-Extraktion unter Einsatz einer Lösung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1 (v/v) wurden die Zielanalyten aus der basisch aufgeschlossenen Haarmatrix gewonnen. Die resultierenden Extrakte wurden bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in Derivatisierungsreagenz, bestehend aus BSTFA und TMCS im Verhältnis 99:1 (v/v), aufgenommen; die Derivatisierung erfolgte bei 110 °C für die Dauer von 20 Minuten. Die resultierende Lösung wurde ebenfalls bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Ein Aliquot davon gelangte zur GC/MS-Analyse (MS im Single Ion Monitoring Mode, SIM).

Die manuelle Methode zum Nachweis von THC, CBN und CBD aus der Matrix Haar ließ sich vollständig automatisieren. Der Fokus unserer Entwicklungsarbeit lag vor allem auf der Probenvorbereitung.

Automatisierte THC-Analyse aus Haaren

Für die Automatisierung der THC-Analyse aus Haaren wurde die DualHead-Ausführung des GERSTEL-MultiPurposeSamplers (MPS) gewählt. Diese Version erlaubt den Einsatz unterschiedlich großer Spritzen, um divergente Lösemittelvolumina zu handhaben, ohne einen Spritzenwechsel vornehmen zu müssen. Darüber hinaus lässt sich der MPS um Module, etwa eine Eindampfstation (mVAP), eine Zentrifuge oder einen Schüttler, erweitern und somit den individuellen applikativen Erfordernissen anpassen.

Unser Plan sah es vor, die Haarproben wie gehabt von Hand zu waschen und zu mahlen, in adäquaten Probenvials vorzulegen und alle weiteren Schritte den MultiPurpose-Sampler ausführen zu lassen. Die Steuerung erfolgte mittels der MAESTRO-Software. Die verschiedenen Schritte wurden vom MPS schließlich erfolgreich wie folgt ausgeführt:

  • 100 mg gemahlene Haare (+ISTD) werden mit 1 M NaOH versetzt und für 13 Minuten (85 °C) inkubiert und aufgelöst.
  • Zweimalige Extraktion mit Hexan/Ethylacetat (9:1 [v/v]) für je 4 min (GERSTEL-quickMIX). Zentrifugieren (4500 UpM) der Extrakte für die Dauer von drei Minuten zwecks Phasentrennung.
  • Extrakte werden im mVAP bei 65 °C bis zur Trockene eingedampft.
  • Aufnahme in MSTFA/Ethylacetat und Mischen (GERSTEL-quickMIX ).
  • Injektion von 2 μL (Inlet-Derivatisierung).
  • Die nachfolgende GC-Trennung erfolgte auf einer Kapillarsäule (DB-5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) von Agilent Technologies; die Detektion im Massenspektrometer im Single Ion Monitoring Mode (SIM).

Erfolgreiche Umsetzung der Automatisierung

Eine Methode ist nur so gut, wie sie sich in der Praxis bewährt. Die Analyse von THC, CBN und CBD aus der Matrix Haar unter Einsatz des MPS zur automatisierten Probenvorbereitung und Probenaufgabe wurde erfolgreich gemäß den Richtlinien der GTFCh validiert. Die Bestimmungsgrenze für THC lag bei 0,01 ng/mg, die Extraktionseffizienz (0,02 ng/mg) bei 99 % und die Wiederholpräzision (0,02 ng/mg) bei 4,2 %.

Was am Ende zu sagen bleibt

In enger Zusammenarbeit des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Gießen und GERSTEL wurde die am Institut genutzte manuelle Methode zum Nachweis von THC, CBN und CBD in Haaren erfolgreich automatisiert; die geforderte Bestimmungsgrenze von 0,02 ng/mg für THC wird erreicht. Die Schritte der Probenvorbereitung werden wie geplant nach Einwaage der gemahlenen Haare vollständig vom GERSTEL-MultiPurpose-Sampler (MPS) ausgeführt, überwacht und gesteuert von der MAESTRO-Software. Deren PrepAhead-Funktion macht eine optimale Verschachtelung von Probenvorbereitung und Analysenlauf möglich. Die der Methode zugrunde liegenden Verfahrensschritte wie Mischen sowie Extraktion und Eindampfen der Extrakte ließen sich mittels der GERSTEL-Module quickMIX, Zentrifuge CF 200 und mVAP eins zu eins von der manuellen Methode übernehmen. Als sinnvoll und effektiv hat es sich erwiesen, die Derivatisierung der Analyten im heißen Inlet auszuführen.

Ungeachtet der Fokussierung auf den Nachweis von THC, CBN und CBD in Haaren lässt sich das hier beschriebene Analysensystem auch für die Automatisierung anderer bislang manuell ausgeführter Flüssig-Flüssig-Extraktionen einsetzen.

Literatur

[1] Das ZEIT-Lexikon in 20 Bänden, Bd. 6, S. 159
[2] Poster Mosbach-Symposium der GTFCh 2015, Sonja Heinl und Freidoon Erdmann (Gießen), Oliver Lerch (Mülheim an der Ruhr), Comprehensive automation of the determination of THC, CBN and CBD in hair by GC/MS

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