Die Multimethode zum Nachweis von neun Mykotoxinen wurde erfolgreich auf einem HPLC-MS/MS-System von Agilent Technologies in Kombination mit einem GERSTEL-MPS (DualHead-Variante) automatisiert. Angelegt wurde ein Lösemittelgradient (A: 5 mM Ameisensäure, B: Acetonitril; Fluss: 0,2 mL/min, 50 °C), bei der stationären Phase handelte es sich um ein C18-Reversed-Phase-Material. Detektiert wurde im positiven ESI-Modus.

Auf der Fahndungsliste
 
Aflatoxine
Aflatoxine werden von verschiedenen Aspergillus-Species, etwa Aspergillus flavus oder Aspergillus parasiticus, gebildet und finden sich vor allen Dingen in Nüssen und Gewürzen. Aflatoxine sind hochtoxisch und kanzerogen, von Bedeutung sind vor allem die Aflatoxine B1, B2, G1 und G2. Sehr häufig wird insbesondere das Aflatoxin B1 in Lebensmitteln gefunden. Weil Aflatoxine thermostabil sind, lassen sie sich nicht durch Kochen zerstören.

Ochratoxine
Neben den Aflatoxinen zählt das Ochratoxin A zu den wohl gefährlichsten Mykotoxinen. Ochratoxin A wirkt nierenschädigend und im Tierversuch kanzerogen. Häufig lässt sich dieses Mykotoxin in Kaffee, Getreide, Bier und Trockenobst nachweisen. Für Ochratoxin A gilt Ähnliches wie für Aflatoxine: Es ist thermostabil und wird zum Beispiel im Kaffeeröstprozess nicht zerstört.

Fusarientoxine
Fusarientoxine werden von diversen Fusarium-Arten und anderen Species produziert und finden sich häufig in Getreide. Zu den Fusarientoxinen zählen unter anderem Zearalenon, T-2-Toxin und HT-2-Toxin. Ihre akute Toxizität wird als gering eingestuft.

Fumonisine
Weltweit verbreitete, stark polare Mykotoxine, die durch Fusarium verticillioides und Fusarium proliferatum insbesondere auf Mais gebildet werden. Die giftigste Verbindung ist Fumonisin B1. Seine Bildung auf Ernteprodukten und Nahrungsmitteln hängt von Umwelteinflüssen wie auch von den Lagerbedingungen ab. Fumonisine sind wasserlöslich und werden während der meisten Prozesse der Lebensmittelverarbeitung nicht inaktiviert.

Chromatogramm einer Standardmischung der Mykotoxine Aflatoxin B1, B2, G1 und G2, Ochratoxin A, Zearalenon, T-2- und HT-2-Toxin sowie Fumonisin B1.

Mykotoxine

Neun auf einen Streich

Produktiv ist, wer mit geringem Aufwand viel erreicht. Die TeLA GmbH, das neuerdings in Geestland bei Bremerhaven ansässige, auf die Untersuchung von Lebensmitteln und Umweltproben spezialisierte Auftragslabor, hat jüngst eine HPLC/MS-Multimethode zum Nachweis neun verschiedener Mykotoxine entwickelt und erfolgreich in die Routineanalytik eingeführt.

Von Franziska Chmelka, Mariia Mathoviskaia und Norbert Helle,
TeLA GmbH, Handelspark 4-6, 27624 Geestland, buero@tela-bremerhaven.de

Die lateinische Bezeichnung mag den Laien an Asterix und Obelix erinnern, die Jagd machen auf römische Legionäre. Doch Kenner wissen: Einem Schimmelpilz namens Aspergillus parasiticus oder Aspergillus flavus kommt man weder mit einem Zaubertrank bei noch mit unbändiger Körperkraft; diese braucht man allenfalls, um das Ekelgefühl im Zaum zu halten, das einen befällt, wird man eines Schimmelpilzes ansichtig, der über Wochen in einer vergessenen Brotdose gewuchert ist.

Der Anblick eines unkontrolliert gewachsenen Schimmelpilzes ist selten appetlich, dennoch ist er harmlos. Gefährliches Potenzial besitzt vielmehr das, was das Auge nicht sieht: Im Zuge ihres Stoffwechsels produzieren Schimmelpilze Gifte, sogenannte Mykotoxine, denen eine chronische und akute Toxizität zugeschrieben wird, teilweise auch krebserregende, erbgutverändernde und hormonaktive Eigenschaften [1].

Die Dosis macht das Gift

Wer Getreide, Nüsse, Früchte, Gewürze und andere Feldfrüchte verarbeitet, wird mit dem Auftreten von Schimmelpilzen rechnen müssen. Schimmel ist ein geradezu ubiquitäres Problem, das sich nicht verhindern, höchstens eindämmen lässt. Dieser Tatsache trägt der Gesetzgeber Rechnung, indem er hinsichtlich der Toxizität Höchstmengen für Mykotoxine festgelegt hat [2]:

Aflatoxin B1: 8,0 μg/kg (Erdnüsse), 0,1 μg/kg (Säuglingsnahrung); Summe der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2: 15 μg/kg (Erdnüsse), 4,0 μg/kg (Getreide)
Ochratoxin A: 10 μg/kg (Kaffee, Rosinen), 0,5 μg/kg (Säuglingsnahrung)
Zearalenon: 200 μg/kg (Mais), 20 μg/kg (Säuglingsnahrung)
T-2-/HT-2-Toxin: noch nicht festgelegt
Fumonisin B1: 2000 μg/kg (Mais), 200 μg/kg (Säuglingsnahrung)

Problem der klassischen Mykotoxinanalytik

Die Vorgabe von Höchstmengen impliziert die Anwendung geeigneter Analyseverfahren und -methoden, mit denen sich die Einhaltung der gesetztlichen Vorgaben überprüfen lässt. Klassischerweise, sprich gemäß §64 Lebens- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB), erfolgt der Nachweis von Mykotoxinen gruppenweise mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion. Vor der Bestimmung erfolgt eine Aufreinigung durch Immunoaffinitätskartuschen. Und teilweise, namentlich bei Aflatoxinen und Fumonisin, ist eine Derivatisierung durchzuführen. Eine HPLC-MS/MS-Methodik ist ausschließlich bei T-2 und HT-2 normiert.

Die herkömmliche Vorgehensweise beim Nachweis von Mykotoxinen ist wirksam, birgt allerdings Optimierungspotenzial in puncto Produktivität. Der Einsatz von Immunoaffinitätskartuschen zwecks Aufreinigung der Proben etwa ist recht teuer. Hinzu kommt der zeit- und arbeitsintensive Aufreinigungsschritt, zumal die verschiedenen Mykotoxine in Gruppen analysiert werden.

Optimierungspotenziale erschließen

Nach genauer Betrachtung der Methode erschien es denkbar, die Effizienz und Produktivität der Mykotoxinanalytik signifikant zu steigern. Optimierungspotenzial wurde an verschiedenen Stellen der Methode ausfindig gemacht. Unter anderem liegt nahe, einen Großteil der Mykotoxine in einer Nachweismethode zusammenzufassen. Und statt die Proben zur Aufreinigung über teure Immunoaffinitätskartuschen laufen zu lassen, könnte eine vergleichsweise günstige Festphasenextraktion zu ähnlichen Resultaten führen. Ein weiteres Plus zeichnete sich ab, da sich sämtliche Schritte der Probenvorbereitung auf einem Standardautosampler automatisieren ließen, was zu einer Arbeitserleichterung führen sollte. Nicht zuletzt erschien es möglich, Spezifität und Empfindlichkeit der Messung zu erhöhen, indem die Fluoreszenzdetektion durch eine MS/MS-Detektion ersetzt würde.

Nach einer hinreichenden Anzahl an Experimenten stand die Multimethode zum Nachweis der Mykotoxine Aflatoxin B1, B2, G1 und G2, Ochratoxin A (OTA), Zearalenon (ZEA), T-2- und HT-2-Toxin und Fumonisin B1. Für die Analyse verwendet wurde ein System bestehend aus einer Agilent 1290 HPLC mit 6495-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer von Agilent Technologies in Kombination mit einem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS) in der DualHead-Ausführung, also ausgestattet mit zwei Türmen, um für die verschiedenen Arbeitsschritte im Rahmen der Probenvorbereitung und Probenaufgabe diverse Werkzeuge verfügbar zu haben.

Automatisierte Probenvorbereitung macht’s möglich

Nach Abschluss der Entwicklungsarbeit stellte sich der Ablauf der Probenvorbereitung, vollständig automatisiert ausgeführt, wie folgt dar: Die SPE-Kartuschen werden mit Methanol und Wasser konditioniert, anschließend dosiert der MPS sieben Milliliter Probe über die Kartuschen. Das Kartuschenbett wird mit vier Millilitern Wasser gewaschen, sodann mit Stickstoffgas getrocknet. Die Elution der Analyten erfolgt mit 1,5 Millilitern Essigester. Das Eluat wird in die MultiPosition Evaporation Station (mVAP) überführt und bis zur Trockene eingedampft; der Rückstand wird letztlich in 500 μL des Laufmittels wieder aufgenommen und in dieser Lösung auf die Trennsäule gegeben.

Level [μg/kg] WDF [%] RSD [%]
Fumonisin 2 79 5,4
T-2 2 105 6,1
HT-2 2 103 6,5
OTA 2 88 4,3
Aflatoxin G2 2 94 5,7
Aflatoxin G1 2 91 4,8
Aflatoxin B2 2 95 4,5
Aflatoxin B1 2 89 3,9
ZEA 2 108 5,9
Validierungsdaten der Multimethode zum Nachweis von neun Mykotoxinen.

Summa summarum wurde das Ziel, eine vollständig automatisierte Multimethode zum Nachweis von Mykotoxinen, namentlich Aflatoxin B1, B2, G1 und G2, Ochratoxin A, Zearalenon, T-2- und HT-2-Toxin sowie Fumonisin B1 erfolgreich in die Praxis umgesetzt. Aus dem vereinfachten Analysenablauf, da alle Mykotoxine der gleichen Probenvorbereitung unterliegen, resultierte eine erhebliche Zeitersparnis im Vergleich zur klassischen manuellen Vorgehensweise. Durch eine zeitliche Verschachtelung von Probenvorbereitung und Analysenlauf (PrepAhead-Funktion) ließ sich die Analysenzeit auf 52 Minuten für die erste Probe sowie 30 Minuten für jede weitere Probe reduzieren.

Überaus zufriedenstellende Resultate

Eine Festphasenextraktion zur Aufreinigung durchzuführen, statt teure Immunoaffinitätskartuschen zu verwenden, ermöglichte es, die Kosten pro Analyse zu senken. Obendrein gelang es, die Fluoreszenzdetektion durch die sehr viel sensitivere und selektivere MS/MSDetektion zu ersetzen, was letztlich auch zu niedrigeren Bestimmungsgrenzen (0,1-0,3 μg/kg) führte. Alles in allem deuteten auch gute statistische Parameter wie Wiederfindung von durchschnittlich 94,6 Prozent und eine relative Standardabweichung von im Mittel 5,2 Prozent auf die erfolgreiche Umsetzung des Vorhabens hin. Die Kalibrierung aller Mykotoxine war von sehr guter Linearität im Bereich von 0,1 bis 10 ng/μL (Aflatoxine, Ochratoxin A und Fumonisin) beziehungsweise 0,5 bis 50 ng/μL (T-2, HT-2 und Zearalenon). In der Routine erweist sich die Mykotoxin-Multimethode als stabil und zuverlässig.

Kalibrierung Aflatoxine
Kalibrierung Ochratoxin A
Kalibrierung Fumonisin
Kalibrierung Fusarientoxine
Sehr gute Linearität über einen weiten Kalibrationsbereich.

Literatur

[1] Guido Deußing, Schnell Gewissheit über geringste Aflatoxinbelastungen, GERSTEL Aktuell 35 (2006) 18-21
[2] Verordnung (EG) Nr. 1881/2006 der Kommission vom 19. Dezember 2006 zur Festsetzung der Höchstgehalte für bestimmte Kontaminanten in Lebensmitteln [VO(EG) Nr. 1881/2006]

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