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Bilder, die unter die Haut gehen: Implantate in der Anwendung.
Aufbau des GERSTEL-Twisters
Der patentierte GERSTEL-Twister dient als Extraktionsmedium für die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE). Der Twister ist ummantelt mit dem Sorptionsmedium, dabei kann es sich um Polydimethylsiloxan (PDMS) handeln oder um eine Ethylenglycol-Silikon-Phase (EG-Silikon-Twister) für die Extraktion bestimmter polarer Verbindungen. Die Extraktion der Analyten erfolgt, während der Twister die Probe durchmischt oder, befestigt an der Innenwand des Probenvials, als Passivsammler.
Twister im TDU-Röhrchen
Desorbiert wird der Twister in der ThermalDesorptionUnit (TDU, im Bild) oder im ThermalDesorptionSystem (TDS). Der Prozess verläuft automatisiert.
Twister wird mittels MPS in die TDU transportiert
Der Extraktion der Analyten mit dem Twister schließt sich die Thermodesorption in der GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU) an, vollständig automatisiert mit dem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS).

Materialanalytik

Implantate und Prothesen im Qualitätscheck

Es bedarf der Bestimmung und Identifizierung auslaugbarer Komponenten (Leachables) unter simulierten In-vivo-Bedingungen, um die Qualität und Verträglichkeit polymerbasierter medizinischer Implantate bewerten zu können. Die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) gefolgt von einer Thermodesorptions- GC-MS/MS-Analyse erweist sich als effizientes Verfahren, wie das folgende Beispiel von „Extractables & Leachables“-Studien an polymerbasierten Tibia- Knie-Inserts verdeutlicht.

Medikamente und deren Inhaltsstoffe dienen der Gesundheit des Patienten, sie sollten ihn auf keinen Fall belasten oder gar krankmachen. Dieses Risiko könnte allerdings bestehen, sollten Chemikalien oder schädliche Stoffe aus der Verpackung in das Arzneimittel migrieren oder unmittelbar im Präparat entstehen. Es ist Sache der Arzneimittelhersteller, ein solches Vorkommnis frühzeitig zu erkennen und geeignete Maßnahmen zu ergreifen.
Im Zuge von „Extractables“-Studien werden Arzneimittelverpackungen in simulierten „Worst-Case“-Szenarien auf migrierende beziehungsweise auslaugbare Chemikalien untersucht, wobei die unbeschädigte Verpackung mit Lösemitteln unterschiedlicher Polarität und bei erhöhter Temperatur extrahiert wird. Man analysiert die Extrakte und die darin enthaltenen Analyten, um einen Überblick zu bekommen, welche Verbindungen das Medikament kontaminieren könnten. Die als kritisch eingestuften Substanzen werden schließlich in „Leachables“-Studien im Arzneimittel selbst unter Einsatz validierter Methoden bestimmt [1].

Auch Implantate müssen sicher sein

Vergleichbar der Pharmaindustrie geht es Herstellern medizinischer Implantate und Prothesen; auch sie sind gehalten, ihre Produkte, bei denen es sich häufig um Materialkombinationen bestehend aus Metall und Kunststoff handelt, auf das Vorhandensein oder das Entstehen von Verbindungen zu untersuchen, die im Verlauf der Anwendung im menschlichen Körper (in vivo) migrieren und zu einer Belastung oder Gefährdung des Patienten führen können. Dieser Sachverhalt macht auch Implantate und Prothesen zum Gegenstand von E&L-Studien.
„Anders als im Fall von Arzneien existieren jedoch für Implantate und Prothesen bislang keine verbindlichen Richtlinien oder Vorgaben für die Durchführung solcher Studien“, bemerkt Gyorgy Vas. Aus diesem Grund orientierte sich der bei der in den USA ansässigen Firma Intertek beschäftigte Wissenschaftler bei seiner im weiteren Verlauf näher beschriebenen Implantat-Forschung an der Art und Weise, wie die Pharmaindustrie E&L-Studien gemäß geltender Normen und Regeln durchführt sowie an den Vorgaben des „Product Quality Research Institute“ (PQRI), einer US-Non-Profit-Organisation, die für genotoxische beziehungsweise kanzerogene Leachables 150 ng/Tag als Migrationsgrenzwert empfiehlt [2].

Nicht gleich, aber vergleichbar

Das PQRI bezieht sich bei seiner Vorgabe auf Resultate, die im Zuge der Untersuchung von Inhalationspräparaten gewonnenen wurden. Gyorgy Vas und Kollegen bewerten diesen Ansatz als „konservativ“ im Sinne einer größtmöglichen Sicherheit für den Patienten und damit als probate Grundlage für das eigene Forschungsvorhaben, schreiben die US-amerikanischen Wissenschaftler im Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [3].
In ihrem Beitrag berichten Vas et al., wie sie aus medizinischen Implantaten, namentlich Tibia-Knie-Inserts, mittels GC-MS/MS-Bestimmung und vorangegangener Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) auslaugbare Komponenten (Leachables) bestimmt haben. Ziel ihrer Arbeit sei es gewesen, eine „systematische Vorgehensweise für die Identifizierung und Quantifizierung antioxidansbezogener auslaugbarer Stoffe aus mit gammastrahlen-behandelten polymeren Knieimplantaten zu entwickeln“, die im Verlauf des Herstellungsprozesses entstehen können.

Von Zusätzen und Rahmenbedingungen

Die von Vas et al. untersuchten Tibia-Knie-Inserts werden aus einem Polyethylen mit ultrahohem Molekulargewicht (UHMW-PE) hergestellt, das nach dem Formprozess mit einer sehr hohen Dosis Gammastrahlen vernetzt und sterilisiert wird. Während durch den Vorgang der Vernetzung die mechanischen Eigenschaften des Kunststoffs verbessert wird, können im Verlauf dieses Prozesses freie Radikale entstehen, die in der Lage sind, das Material anzugreifen und seine chemische und mechanische Langzeitstabilität zu beeinträchtigen.
Um einen Oxidationsprozess im Kunststoff zu unterbinden und die Produktstabilität zu verbessern, wird dem Polymer ein Antioxidans, zum Beispiel Pentaerythritoltetrakis(3-[3,5-di-tertiär-Butyl-4-Hydroxyphenyl] Propionat) beigemischt. Aufgabe des kurz als PBHP bezeichneten Additivs ist es, die gebildeten freien Radikale zu entfernen, oxidative Reaktionen im Kunststoff zu verhindern und die Langzeitstabilität des Produkts zu verbessern.
PBHP kann allerdings einem eigenen Zersetzungsprozess unterliegen, in dessen Verlauf Abbauprodukte aus dem Implantat in das umliegende Gewebe migrieren könnten. Die Identifizierung und Bestimmung solcher PBHP-Abbau- und Nebenprodukte – es wurden insgesamt 16 festgestellt – in simulierten In-vivo-Experimenten mit Knieimplantaten, deren Lebensdauer zwischen zehn und 30 Jahren liegt, erweise sich als zwingend erforderlich, betonen die Wissenschaftler.
Großformatige Produkte, wie im vorliegenden Fall größere Implantate, erfordern allerdings auch große Volumina biologisch relevanter und damit wässriger Medien für die Untersuchung auslaugbarer Stoffe; letzten Endes bekomme man Lösungen, in denen die Zielkomponenten in sehr niedrigen Konzentrationen vorlägen. Die Analyten seien aufzukonzentrieren, schreiben Vas et al., um eine Quantifizierung gemäß PQRI-Vorgabe zu ermöglichen. Die Probenvorbereitung sei allerdings, auf herkömmliche Weise durchgeführt, zeitaufwendig und aufgrund der erforderlichen großen Mengen organischer Lösemittel ökonomisch und ökologisch fragwürdig.

Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) als Mittel der Wahl

Die Quantifizierung auslaugbarer Stoffe erfordert einen Anreicherungsschritt aufgrund des geringen Gehalts extrahierbarer Stoffe im wässrigen Medium. Naheliegend wäre es, das Lösemittel zu verdampfen, was jedoch den Verlust flüchtiger Komponenten und die Bildung von Störstoffen zur Folge haben könnte, befürchten Vas et al. Zudem seien die wässrigen Extrakte, die zur Simulierung von In-vivo-Systemen bei Studien über auslaugbare Stoffe verwendet werden, nur schwer GC/MS kompatibel, was einen zweiten Extraktionsschritt mit einem apolaren, GC-gängigen Lösemittel zur Folge hätte.
Um die komplexen analytischen Herausforderungen zu meistern, favorisierten und validierten die Wissenschaftler für ihr Vorhaben, nach einem hinreichenden Vergleich gängiger Methoden, die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) mit dem PDMS-Twister als Extraktionsmedium mit anschließender GC- MS/MS-Bestimmung.
Im Gegensatz zu anderen Extraktionstechniken ermöglicht es die SBSE, auslaugbare Stoffe in einem einzigen Schritt zu extrahieren und zu konzentrieren – ohne weitere, umfangreiche Probenbearbeitung im Vorfeld der GC/MS-Analyse. Obendrein verfüge der PDMS-Twister über eine unvergleichbar größere PDMS- beziehungsweise Sorbensmenge als zum Beispiel die Solid Phase Micro Extraction (SPME): „Die SBSE ist von Fall zu Fall signifikant sensitiver in Bezug auf den Nachweis organischer Verbindungen aus wässrigen Matrices als die SPME“, konstatieren Vas et al.

Blick auf die technischen Details

Und so gingen die Wissenschaftler vor: Die Implantate wurden in Gänze (!) für die Dauer einer definierten Zeit (24 Stunden und 30 Tage) in ein wässriges Extraktionsmedium (500 mL einer Wasser/Aceton-Lösung im Verhältnis von 90:10 gemischt) getaucht; die Lösung wurde anschließend mit dem Twister durchmischt (2 Std / 1000 UpM), wobei die Extraktion und Anreicherung der organischen Bestandteile in den PDMS-Sorptionsmantel des Twisters erfolgt [4]. Der Twister wurde der Lösung entnommen, mit entionisiertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Die Thermodesorption der extrahierten Komponenten in der ThermalDesorptionUnit (GERSTEL-TDU) schloss sich an, vollständig automatisiert mit dem MultiPurposeSampler (GERSTEL-MPS) sowie deren temperaturprogrammierte Überführung auf den mit einem KaltAufgabeSystem (GERSTEL-KAS) als PTV-Injektor ausgestatteten GC 7890 (Agilent Technologies). Detektiert wurde mit einem Agilent Triple-Quadrupol-MS.

Ende gut, alles gut

Mit der von ihnen entwickelten und validierten SBSE-GC-MS/MS-Methode konnten Gyorgy Vas und Kollegen auslaugbare Komponenten in Spuren (< 150 ng/Tag) aus medizinischen Implantaten bestimmen. Aus den Implantaten, die 24 Stunden lang extrahiert wurden, ließen sich keine genotoxischen oder potenziell kanzerogene Stoffe über 150 ng/Tag nachweisen, schreiben die Wissenschaftler. Ihre Methode sei spezifisch für die identifizierten PHBP-Abbauprodukte, zudem linear zwischen 40 und 6000 pg/mL. Angewandt wurde die SBSE-GC-MS/MS-Methode auf elf Tibia-Knie-Implantate unterschiedlicher Größe, die nicht – wie häufig üblich – nach Manipulation nur in Bruchstücken, sondern im Ganzen extrahiert wurden. Der größte Teil der Probenvorbereitung sei automatisiert verlaufen oder habe nur minimale manuelle Arbeit erfordert. Aggressive oder gesundheitsschädliche Lösemittel wurden für die Extraktion nicht eingesetzt, was bei allem Mehrwert obendrein das Arbeitsumfeld und damit das Laborpersonal entlaste.

Quellen und weiterführende Literatur

[1] GERSTEL Aktuell 42 (2010) 15-17
[2] Summary of the PQRI Leachables and Extractables Recommendations
[3] J. Pharm. Biomed. Anal. 74 (2013) 62-70
[4] GERSTEL Aktuell 44 (2011) 18-20

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