Probenvorbereitung und HPLC-Analyse verlaufen zeitlich effizient verschachtelt.

Standardmischung der Zielanalyten (100 ng/L) nach Extraktion und Aufreinigung unter Einsatz der SPE^xos-Einheit.

Deutliche Sensitivität: Vergleich der HPLC-Triple-Quad-Bestimmung einer Standardmischung (100 ng/L) nach SPE^xos und Direktinjektion von 50 μL (d).

Standardmischung der Zielanalyten (10 ng/L) nach Extraktion und Aufreinigung unter Einsatz der SPE^xos-Einheit. Für alle untersuchten Substanzen wurde eine Bestimmungsgrenze (LoQ) von < 10 ng/L erreicht.

Verwendetes SPE^xos-HPLC-Triple-Quad-System zur Bestimmung von Phenylharnstoff- und Triazin-Herbiziden.

Einsetzen der SPExos-Kartusche
Konditionierung mit 4 mL Methanol
Konditionierung mit 4 mL Wasser
Laden von 1 mL Probe in die Probenschleife am MPS
Transfer der 1mL Probe aus der Probenschleife auf die SPExos-Kartusche mittels 1,5 mL Wasser
Ventilschaltung: Fluss der binären Pumpe wird über die SPExos-Kartusche geschaltet
Überführung auf die LC-Säule

Automatisiert ausgeführte Schritte der Probenvorbereitung.

LC/MS-Parameter

Die Parameter für die LC/MS-Analyse gestalten sich wie folgt: Eluent A: Ameisensäure 5 mmol/L; Eluent B: Acetonitril, bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,35 mL/min: 0 min: 5 % B – 10 min: 50 % B – 22 min: 100 % B – 22,1 min: 5 % B – Stoppzeit: 28 min. Säulenofentemperatur: 60 °C, Säule: C18-Material. Die Einstellungen am MS (Quelle: Agilent Jetstream): ESI positiv, Gas Temp: 300 °C, Gas Flow: 9 L/min, Nebulizer: 45 psi, Sheath Gas Temp: 270 °C, Sheath Gas Flow: 12 L/min, Capillary: 5500V, Nozzle: 300 V.

Screenshot des Probenvorbereitungsablaufs innerhalb der MAESTRO-Software. Die Zusammenstellung der Methode ist intuitiv möglich durch die Wahl der erforderlichen Schritte aus einem übersichtlichen Menü. Probenvorbereitung und HPLC-Analyse verlaufen zeitlich effizient verschachtelt.

Rückstandsanalytik

Herbizide bestimmen – geht‘s noch sensitiver?

Die Bestimmung von Pestizidrückständen in Nahrungsmitteln und Wasser ist fester Bestandteil der Routineanalytik eines Auftragslabors, das sich auf die Kontrolle und Überwachung der Güte und Qualität von Lebens- und Nahrungsmitteln fokussiert hat. Effizienz ist dabei unerlässlich. Die Strategie liegt in einer taktisch klugen Automatisierung. Die Online-SPE (SPE^xos) von GERSTEL mit zusätzlicher Aufreinigung gewährleistet höhere Sensitivität bei gleichzeitig niedrigen Bestimmungsgrenzen.

Zu den häufig vor allem im Obstanbau eingesetzten Unkrautvernichtungsmitteln (Herbiziden) gehören Präparate, die Phenylharnstoff- oder Triazinderivate enthalten. Beide Wirkstoffklassen werden von der Pflanze über die Wurzeln aufgenommen und in die Chloroplasten transportiert, wo sie den Prozess der Photosynthese stören, was letztlich zu einem Absterben der Pflanze führt.
Es liegt in der Natur der Unkrautvernichtung mittels chemischer Präparate, dass Rückstände, auch von Pestiziden, die nach ihrer Ausbringung vornehmlich in der obersten Bodenschicht verbleiben, die tieferliegenden Wurzeln der Kulturpflanze erreichen und von dieser aufgenommen oder noch weiter in die Umwelt eingetragen werden. Bekannt ist, dass Pestizide vor allem in Grund- und Oberflächenwasser, wichtige Trinkwasserspeicher, einsickern.
Um eine Gesundheitsgefährdung durch Pestizidrückstände zu minimieren, hat der Gesetzgeber die Belastung des Trinkwassers bezogen auf den einzelnen Wirkstoff beziehungsweise relevante Metaboliten auf 0,1 μg/L begrenzt. Ein geeignetes Analysenverfahren sollte mit 0,01 μg/L eine Bestimmungsgrenze aufweisen, die noch um eine Zehnerpotenz niedriger ist. Diese zu erreichen wird konventionell oft nur möglich durch eine Anreicherung der Analyten aus einem großen Probenvolumen (einige 100 mL) mit anschließender Injektion eines Aliquots des (reduzierten) Extrakts in ein leistungsfähiges, sensitives HPLC/MS-System. Ungeachtet dessen lassen sich nicht immer alle Substanzen bestimmen.
Aktuell geht man dazu über, größere Probenvolumina (bis 100 μL) direkt in das LC-System zu injizieren. Alternativ lassen sich die fraglichen Analyten mittels Online-Festphasenextraktion (SPE) auf festinstallierten Sammelkartuschen anreichern; ein weitverbreitetes, gängiges Prozedere. Beide Maßnahmen sind allerdings mit gewissen Nachteilen verbunden:
Die Injektion großer Probemengen (bis 100 μL) kann oftmals zu einer ungünstigen Peakverbreiterung führen. Zudem bedarf es meist eines hochsensitiven, meist hochpreisigen Analysengeräts, um die geforderten Bestimmungsgrenzen zu erreichen.
Die Anreicherung der Analyten auf festinstallierten SPE-Kartuschen wiederum führt nicht selten zu störenden Substanzverschleppungen; ferner ist der damit verbundene vermeintliche Aufreinigungseffekt eher gering: Da die Kartusche üblicherweise von einer Seite beladen und in Gegenrichtung eluiert wird, können Störkomponenten leicht zusammen mit den Analyten auf die Trennsäule gelangen.

Online-Festphasenextraktion plus Aufreinigung

Die Idee lag nahe, den Aufreinigungsschritt der oben beschriebenen Online-SPE-Anreicherung effektiver zu gestalten. Zur Anreicherung einer 1-mL-Wasserprobe verwendeten wir ein spezielles Online-Modul (GERSTEL-SPE^xos), das eben dies erlaubt. Einige technische Details: Verglichen mit der klassischen SPE arbeitet das SPE^xos-Modul mit kleineren Kartuschen; die Sorbensmasse beträgt nur 15 mg im Unterschied zur herkömmlichen SPE mit 50 bis 1000 mg. Die Extraktion lässt sich vollständig in den HPLC-Prozess integrieren, wobei die Elution der Analyten mit signifikant weniger Lösemittel erfolgt. Die SPE^xos-Einheit wird unmittelbar zwischen Autosampler (GERSTEL-MultiPurposeSampler, MPS) und Chromatographie-System (Agilent 1260 HPLC/Triple Quad-MS 6460) geschaltet. Die Aufgabe erfolgt online, das heißt, das Eluat – und damit 100 Prozent der Analyten – wird direkt auf das HPLC-System überführt. Die Analyse erfordert, das zeigte die Praxis, somit nur eine geringe Probenmenge (1-5 mL), verläuft schnell und ermöglicht einen hohen Probendurchsatz. Ansteuern und in die Methode der Probenvorbereitung einbinden lässt sich die SPE^xos-Einheit komfortabel per Mausklick im Menü der MAESTRO-Steuersoftware; die Probenvorbereitung wiederum verläuft auf Wunsch zeitlich mit Chromatographie und Detektion der Analyten verschachtelt (PrepAhead-Funktion).
Der Einsatz eines SPE^xos-Moduls, überlegten wir bei der Methodenplanung, barg einige interessante, der Sache dienliche Aspekte: Da sich die SPE-Kartuschen automatisiert vor jeder Probe auswechseln lassen, war mit Verschleppungen nicht zu rechnen. Der Reinigungseffekt wäre größer, da die Analyten das gesamte Sorbensbett der Kartusche in Beladungsrichtung zu durchwandern hätten und Störkomponenten somit effektiver zurückgehalten würden; zudem wären unterschiedliche beziehungsweise spezifische Clean-up-Schritte denkbar und möglich, da sich verschiedene Sorbensmaterialien einsetzen ließen, wahlweise auch sequenziell. Die Fokussierung der Analyten, die sich vollständig und verlustfrei von der kompakten Kartusche auf die Trennsäule überführen lassen, hätte schmale Peaks zur Folge. Soweit die Theorie. Die Praxis gestaltete sich wie folgt. Als einziger manueller Arbeitsschritt wurden die Wasserproben in Vials abgefüllt und auf dem MPS-Autosampler in Position gebracht. Die weiteren Schritte verliefen von der Software gesteuert vollständig automatisiert (siehe Ablaufdiagramm).

Schlussbetrachtung der Pestizidbestimmung

Jede Methode ist nur so gut, wie sie sich in der Praxis bewährt. Der Einsatz des SPE^xos- Moduls, das eine Anreicherung der Analyten bei gleichzeitiger Aufreinigung des Extraktes sowie einen Wechsel der Kartuschen von Probe zu Probe zur Minimierung von Carry-over zulässt, erwies sich als treffend. Bestimmt wurden folgende Analyten: Metolachlor, Metazachlor, Diuron, Terbuthylazin, Metoxuron, Methabenzthiazuron, Chloridazon, Atrazin, Metribuzin, Chlortoluron, Isoproturon, Metamitron, Desethylatrazin und Desisopropylatrazin in jeweils einem Milliliter Wasserprobe.
Das Resultat unserer Methodenentwicklung kann sich sehen lassen: Im Vergleich zu einer Direktinjektion von 50 μL erreichten wir eine Steigerung der Sensitivität um den Faktor 50 – ohne Peakverbreiterung. Lediglich die Retentionszeit verschob sich um eine halbe Minute nach hinten. Verschleppungen (carry-over) wurden nicht beobachtet. Neben der Steigerung der Sensitivität wurde ein deutlich saubererer Extrakt erhalten, was sich langfristig positiv auf das Analysensystem auswirkt. Nicht zuletzt wurde für alle untersuchten Substanzen eine Bestimmungsgrenze von < 10 ng/L erreicht. Die Kalibrierung ergab eine durchweg gute Linearität.