Schematische Darstellung der Multi-SBSE
Schematische Darstellung der Multi-Stir Bar Sorptive Extraction (mSBSE): Die Extraktion der Analyten erfolgte zeitgleich mit PDMS- und EG-Silikon-Twister, ebenso deren anschließende Thermodesorption und GC/MS-Analyse.
Wiederfindung gegen Log KOW
Vergleich der Wiederfindung von Testaromen zwischen der klassischen SBSE mit nur einem Twister und der Multi-SBSE unter Einsatz mehrerer Twister. Zum Einsatz kamen 24-μL-PDMS- und 32-μL-EG-Silikon-Twister; analysiert wurden 5 mL Probe (10 ng/ mL, versetzt mit 30 % NaCl). Die SBSE dauerte zwei Stunden und wurde auf unterschiedliche Weise durchgeführt: A) mit einem PDMS-Twister, B) mit einem EG-Silikon-Twister, C) zeitgleich mit einem PDMS- und einem EG-Silikon-Twister (mSBSE) und D) zeitgleich mit zwei PDMS- und zwei EG-Silikon-Twistern (mSBSE).
Total-Ion-Chromatogramm
Total-Ion-Chromatogramm der Analyse von geröstetem grünen Tee mittels Multi-SBSE und anschließender Thermodesorption und GC/MS-Analyse:
1. Furfurylalkohol (log KOW 0,45),
2. Benzylalkohol (log KOW 1,08),
3. Phenethylalkohol (log KOW 1,57),
4. cis-3-Hexenol (log KOW 1,61),
5. 1-Hexanol (log KOW 1,82),
6. 2,6-Dimethyl-1,3,7-octatrien-6-ol (log KOW 3,24),
7. Linalool (log KOW 3,38),
8. Geraniol (log KOW 3,47),
9. Citronellol (log KOW 3,56),
10. Furfural (log KOW 0,83),
11. 6-Methyl-5-hepten-2-on (log KOW 2,06),
12. cis-Jasmon (log KOW 3,55),
13. Guajacol (log KOW 1,34),
14. p-Cresol (log KOW 2,06),
15. Vinylguajacol (log KOW 2,24),
16. p-Vinylphenol (log KOW 2,41),
17. p-Ethylphenol (log KOW 2,55),
18. 2-Methylpyrazin (log KOW 0,49),
19. 2,5-Dimethylpyrazin(log KOW 1,03),
20. 2-Ethyl-5-methylpyrazin (log KOW 1,53),
21. 5,6,7,8-Tetrahydroquinoxalin (log KOW 1,90),
22. 2-Ethyl-3,5-dimethylpyrazin (log KOW 2,07),
23. 2-Acetylpyrrol (log KOW 0,56),
24. 2-Formylpyrrol (log KOW 0,60),
25. 1-Ethyl-2-formylpyrrol (log KOW 1,14),
26. 1-Ethylpyrrol (log KOW 1,92),
27. Indol (log KOW 2,05),
28. 2-Methylindol (log KOW 2,60),
29. 2-Acetylthiazol (log KOW 0,67),
30. Coumarin (log KOW 1,51),
31. 2-Formylthiophen (log KOW 1,53),
32. 2,4,5-Trimethyloxazol (log KOW 1,86).
Balkendiagramme
Vergleich der normierten Fläche (roter Balken = 1) einiger ausgewählter Aromastoffe zwischen der klassischen Einzel-SBSE- und der Multi-SBSE-Analyse.
Chromatogramme
Selected-Ion-Chromatogramm (SIM) von Bier nach der derivat-SBSE-TDU-GC/MS-Analyse. Dotiert war das Bier mit jeweils 500 pg/mL E-2-Octenal (1, 1‘), E-2-Nonenal (2, 2‘) und E, E-2,4-Decadienal (3, 3‘). Zur Derivatisierung der Aldehyde wurde Pentafluorbenzylhydroxylamin (PFBHA) eingesetzt. Es bilden sich syn- und anti-isomere, was zu je zwei Signalen führt, gekennzeichnet mit i (Zahl) beziehungsweise i’. 
Chromatogramm
Selected-Reaction-Monitoring-Chromatogramm (SRM) von dotiertem (1-10 ng/L) und nicht-dotiertem Bier nach der derivat-SBSE-TDU-GC-MS/MS-Analyse. 

Getränkeanalytik

Dem Geschmack auf der Spur

Die Multi-SBSE (mSBSE) und SBSE mit In-situ-Derivatisierung (derivat-SBSE) lassen sich erfolgreich sowohl für die nicht-zielgerichtete Analyse in einem weiten Bereich von Aromaverbindungen einsetzen wie auch für die gezielte Analyse von Fehl- und Schlüsselaromen. Beide SBSE-Formen lassen sich kombinieren, um in Verbindung mit GC/MS- und High-End-GC/MS-Systemen den Informationsgehalt einer Analyse zu vergrößern.

 

Von Dr. Nobuo Ochiai, GERSTEL K.K., Tokio, Japan

 

Die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) mit dem GERSTEL-Twister wird seit langem erfolgreich bei der Analyse von Lebensmitteln und Getränken eingesetzt, insbesondere auch zur Bestimmung aromaaktiver Verbindungen in Wasser, Getränken, Obst, Kräutern oder Essig [1-3]. In der Literatur finden sich vornehmlich Applikationen, die über den Einsatz von mit Polydimethylsiloxan (PDMS) beschichteten Twistern berichten; weitere Sorptionsphasen wurden ab 2011 getestet und eingesetzt.

Fokus auf die SBSE-Sorptionsphase

Der Extraktionserfolg der SBSE mit dem PDMS-Twister lässt sich mittels des Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (KOW) abschätzen. Hydrophobe (unpolare) Verbindungen mit einem hohen KOW werden mit guter Wiederfindung extrahiert, hydrophile (polare) mit einem niedrigen KOW mit eher geringerer Wiederfindung. Der PDMS-Twister reichert daher selektiv vor allem hydrophobe Verbindungen an; der Extraktionsprozess führt oft zu einem Chromatogramm, das in Richtung weniger hydrophiler gelöster Stoffe verschoben ist.

Der seit 2011 verfügbare sogenannte EG-Silikon-Twister ist von einem Polyethylenglykol-modifiziertem Silikon als Sorptionsphase ummantelt und wurde inzwischen unter anderem zur Analyse von Whisky, Wein, ätherischen Ölen und aufgebrühtem Kaffee eingesetzt [4, 5]. Die im Gegensatz zum PDMS polarere Copolymer-Beschichtung zeigt eine gute Leistung bei der Extraktion von Phenolen und anderen polaren Wasserstoffbrückendonatoren. Um gleichzeitig das Potenzial beider Twister-Phasen ausschöpfen zu können, wurde 2013 mit der Multi-SBSE (mSBSE) ein neues SBSE-Verfahren entwickelt.

Das ganze Potenzial der SBSE erschließen

Bei der Multi-SBSE (mSBSE) [6] kommen sowohl der PDMS- als auch der EG- Silikon-Twister zum Einsatz: Während der PDMS-Twister die Probe in klassischer Weise wie ein Rührfisch durchmischt und dabei die in Lösung befindlichen hydrophoben Analyten extrahiert, wird der EG-Silikon-Twister innen mit einem magnetischen Klipp (GERSTEL-Twicester) an der Seitenwand des Vials befestigt. Nach Abschluss der Extraktionszeit werden beide Twister dem Vial entnommen und zugleich in der GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU) thermisch desorbiert. Der Einsatz beider Twister-Typen ermöglicht die gleichmäßige Anreicherung von Aromen eines weiten Polaritätsbereichs.

Für die Extraktion (und Analyse) bestimmter hydrophiler/polarer gelöster Stoffe kann die SBSE auch in Verbindung mit einer In-situ-Derivatisierung (derivat-SBSE), etwa Acylierung, Veresterung oder Oximierung, eingesetzt werden. Die Derivate polarer beziehungsweise hydrophiler Stoffe mit niedrigen KOW-Werten besitzen im Allgemeinen höhere KOW-Werte und lassen sich folglich mit besserer Wiederfindung mittels SBSE extrahieren und bestimmen [1]. Das höhere Molekulargewicht eines Derivats wirkt sich zudem günstig auf die Selektivität und Nachweisstärke der GC/MS-Analyse aus.

In dieser Arbeit werden zwei Vorgehensweisen der Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) für die Analyse von Aromen und Fremdaromen in Getränken beschrieben: die mSBSE sowie die derivat-SBSE. Die mSBSE überzeugte bereits zum Beispiel im Zuge einer gleichmäßigen Anreicherung von Aromaverbindungen eines weiten Polaritätsbereiches aus geröstetem grünen Tee. Mittels derivat-SBSE wurden schon Schlüssel- und Fremdaromen in Bier analysiert.

mSBSE für die nicht-zielgerichtete Analyse von Aromaverbindungen

Wiederfindungsvergleich zwischen Einzel-SBSE und mSBSE: Die mSBSE erfolgte gemäß der schematischen Abbildung mit einem 24-μL-PDMS-Twister und einem 32-μL-EG-Silikon-Twister aus einer 5-mL-Probe nach Zugabe von 30 % NaCl. Beide Twister wurden im Anschluss mit einem Splitverhältnis von 1:1 in der GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU) thermisch desorbiert unter Anwendung der Low-Split-Option. Die Trennung der Analyten erfolgte auf einer DB-Wax- Säule (30 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm Schichtdicke), die Detektion im Scan- Modus.

Die mit der mSBSE erhaltenen Wiederfindungsraten bei der Extraktion unterschiedlicher Arten und Klassen von Testaromen, darunter Alkohole, Ester, heterozyklische Verbindungen, Ketone und Phenole, aus Wasser, wurden mit jenen Werten verglichen, die mit der klassischen (Einzel-)SBSE mit nur einem Twister erhalten wurden. Die log-KOW-Werte der Testverbindungen lagen im Bereich von 1,34 (Guajacol) bis 4,21 (β-Damascenon).

Die Konzentration der Testverbindungen betrug jeweils 10 ng/mL. Um zu überprüfen, welche Vorgehensweise in Bezug auf die Wiederfindung der Analyten die besten Resultate liefert, wurden verschieden SBSE-Strategien miteinander verglichen (siehe Abbildung):

  • (A) Einzel-SBSE mit dem PDMS-Twister (1x);
  • (B) Einzel-SBSE mit dem EG-Silikon-Twister (1x);
  • (C) mSBSE mit dem PDMS-Twister (1x) und dem EG-Silikon-Twister (1x);
  • (D) mSBSE mit zwei PDMS-Twistern (2x) und zwei EG-Silikon-Twistern (2x) (ein PDMS-Twister rührt, während der andere PDMS-Twister und die beiden EG- Silikon-Twister an der Innenwand des Vials befestigt waren).

Unter Bedingung (A) zeigten die gelösten Stoffe mit einem log KOW > 2,5 Wiederfindungsraten größer 80 Prozent, während die gelösten Stoffe mit einem log KOW < 2,5 niedrigere Wiederfindungsraten aufwiesen, insbesondere Guajacol (log KOW 1,34, Wiederfindung 8,3 %) und Phenethylalkohol (log KOW 1,61, Wiederfindung 10 %).

Unter Bedingung (B) zeigten die gelösten Stoffe mit log KOW > 2 Wiederfindungsraten größer 70 Prozent, während die gelösten Stoffe mit log KOW < 2 auch niedrige Wiederfindungsraten zeigten. Im Vergleich mit Bedingung (A) stiegen die Wiederfindungsrate von Guajacol (log KOW 1,34) und Indol (log KOW 2,05) von 8,3 auf 21 % beziehungsweise von 29 auf 71 %, während sich die Wiederfindungsrate für β-Damascenon (log KOW 4,21) von 96 auf 74 % reduzierte.

Unter Bedingung (C) wurden im Vergleich zur Einzel-SBSE (A, B) größere Wiederfindungsraten für alle gelösten Teststoffe festgestellt, eine Ausnahme bildete Indol (log KOW 2,05, Wiederfindung 60 %).

Bedingung (D) erbrachte für gelöste Stoffe mit einem log KOW < 2,5 die größten Wiederfindungsraten. Die mSBSE-Vorgehensweise verbindet nicht allein die Extraktionskraft des PDMS-Twisters mit dem Leistungsvermögen des EG- Silikon-Twisters; sie führt auf Grund des größeren Phasenvolumens (kleineres Phasenverhältnis) auch zu höheren Wiederfindungsraten.

Analyse von grünem Tee

Grüner Tee enthält in Spuren (pg/mL bis ng/mL) aromaaktive Verbindungen, was einen wirksamen Extraktions- und Anreicherungsschritt vor der GC/MS-Analyse ratsam macht zur Steigerung der Empfindlichkeit. Verschiedene Probenvorbereitungstechniken wie die Flüssigphasenextraktion, die Gasphasenextraktion/-destillation sowie die Festphasenextraktion wurden für Isolierung und Extraktion von Aromaverbindungen in grünem Tee vorgeschlagen.

Deren wesentliches Manko ist jedoch die Handhabung vergleichsweise großer Probenvolumina von 3 bis 30 L [7] sowie die Tatsache, dass der Anreicherungsfaktor (ursprüngliches Probenvolumen gegen endgültiges Extraktionsvolumen, das mit diesen Techniken erreichbar ist) limitiert ist und einen zusätzlichen Probenvorbereitungsschritt zur Aufkonzentrierung des Extraktes auf Volumina <1 mL erfordert.

Als ein Beispiel für die Spurenanalyse einer großen Vielfalt von Aromen wurde gerösteter grüner Tee (Houji-cha) analysiert. Der Maillard-Reaktions- Röstprozess nimmt dem Houji-cha-Tee das feine grüne, vegetative Aroma von gewöhnlichem grünem Tee und ersetzt es durch komplexere röstartige, nussige und karamellähnliche Noten [8]; diese Aromen sind jedoch nur in Spuren vorhanden. Die Abbildung zeigt ein TIC von geröstetem grünen Tee, das aus der mSBSE mit dem PDMS-Twister (1x) und dem EG-Silikon-Twister resultierte. Eine Vielfalt an gelösten Stoffen, die zum Aroma des gerösteten grünen Tees beitragen, wurden im Chromatogramm einer Probe von nur 5 mL detektiert, einschließlich Coumarin (log KOW 1,05), Guajacol (log KOW 1,34), p-Cresol (log KOW 2,06), Indol (log KOW 2,05), 2-Ethyl-3,5-dimethylpyrazin (log KOW 2,07), Linalool (log KOW 3,38), Geraniol (log KOW 3,47) und cis-Jasmon (log KOW 3,55). Die meisten dieser gelösten Stoffe wurden im Bereich von 7,0 bis 43 ng/mL mit der Standard-Additionsmethode bestimmt [6].

Die Balkendiagrammdarstellung zeigt den Vergleich der normierten Fläche einiger Aromaverbindungen zwischen der Einzel-SBSE mit dem PDMS-Twister, der Einzel-SBSE mit dem EG-Silikon-Twister sowie der mSBSE mit PDMS- und EG- Silikon-Twister. Stoffe, die als Wasserstoffbrückenbindungsdonatoren fungieren können, lassen sich mit dem EG-Silikon-Twister gut extrahieren, während sich einige heterozyklische gelöste Stoffe wie 2,5-Dimethylpyrazin, 2-Ethyl-5-Methylpyrazin und 2,4,5-Trimethyloxazol vor allem mit dem PDMS-Twister anreichern lassen.

Bier: SBSE mit In-situ-Derivatisierung für die gezielte Analyse von Fremd- und Schlüsselaromen

Oxidativ produzierte ungesättigte Aldehyde spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Fehlaromen (Schalgeschmack) in Bier. E-2-Nonenal wurde wegen der sehr niedrigen Geruchsschwelle von 0,1 ng/mL als Hauptquelle des papier- und kartonartigen Fehlaromas angesehen [9]. Die Analyse von E-2-Nonenal und ähnlichen Verbindungen in Bier ist aufgrund des hohen Anteils störender Matrixbestandteile wie Fuselalkohole, Fettsäuren und Ester alles andere als trivial. Eine einfache und effektive Methode, die störenden Matrixeinflüsse während der Probenvorbereitung und GC-Analyse zu reduzieren, ist die Derivatisierung. E-2-Nonenal und ähnliche Verbindungen lassen sich anreichern und mittels GC/MS selektiv bestimmen, wenn im Zuge der SBSE mit In-situ- Derivatisierung (derivat-SBSE) gearbeitet wird.

Pentafluorbenzylhydroxylamin (PFBHA) wurde eingesetzt, um die in den Fokus geratenen Zielaldehyde (log KOW 2,57 – 3,33) in ihre entsprechende Oxime (log KOW 5,36 – 6,13) zu überführen; deren Nachweis erfolgte hochselektiv und empfindlich (LOD 21 – 32 pg/mL) [10].

Das Chromatogramm (s. o.) zeigt die Analyse einer Bierprobe, die mit 500 pg/ mL einer Mischung aus drei Aldehyden (E-2-Octenal, E-2-Nonenal und E,E-2,4- Decadienal) dotiert worden war. Die Extraktion erfolgte mittels derivat-SBSE unter Verwendung eines 47-μL-PDMS-Twisters aus einer 30-mL-Probe (10fach verdünnt mit Wasser) nach Addition von 0,45 mL PFBHA-Lösung (10 mg/mL). Im Anschluss daran wurden die Oxime im Splitlos-Modus thermisch desorbiert, die Trennung erfolgte auf einer HP-5MS-Säule (30 m x 0,25 mm ID x 0,25 mm Schichtdicke) die Detektion im SIM-Modus mittels Massenspektrometer.

Als Aromastoffe finden sich Thiole oft in Lebensmitteln und Getränken. Thiole besitzen eine extrem niedrige Geruchsschwelle und einen sehr hohen sensorischen Einfluss. Einige Thiole, dazu zählen 4-Mercapto-4-Methylpentan- 2-on (4MMP), 3-Mercaptohexan-1-ol (3MH) und 3-Mercaptohexyl-Acetat (3MHA), sind maßgeblich für das tropisch-fruchtige Zitrusaroma verantwortlich. Bei hopfenreichen Bieren liegen die Duftschwellen im Bereich von ng/L [11]; sehr empfindliche und selektive Methoden sind erforderlich, will man Thiole zufriedenstellend bestimmen. Für den Nachweis oben genannter Thiole wurde vom Autor in Zusammenarbeit mit Kollegen eine derivat-SBSE-Methode entwickelt unter Verwendung eines 24-μL-PDMS-Twisters und dem Ester der Propiolsäure als Derivatisierungsreagenz. Nach Extraktion der Derivate und ihrer Thermodesorption in der TDU erfolgte die GC-Trennung mit anschließender QQQ-MS-Detektion im SRM-Modus. Das Resultat dieser Messung spiegelt die Abbildung wider, in der das SRM-Chromatogramm einer im Bereich von 1–10 ng/L dotierten Bierprobe überlagert ist von dem SRM-Chromatogramm der nicht dotierten Bierprobe. Bei 17,18 min erscheinen Thioacrylate von 3-MHA (cis-Derivate) im SRM-Chromatogramm. Diese Verbindung wurde unter ihrer Geruchsschwelle von 5,0 ng/L detektiert.

Schlussfolgerung oder was am Ende zu sagen bleibt

Multi-SBSE (mSBSE) und SBSE mit In-situ-Derivatisierung (derivat-SBSE) können erfolgreich sowohl für die nicht-zielgerichtete Analyse eines weiten Bereichs von Aromaverbindungen eingesetzt werden als auch für die gezielte Analyse von Fehlaroma- und Schlüsselaromaverbindungen. Beide SBSE-Techniken lassen sich sehr gut miteinander kombinieren, etwa, wie in diesem Beitrag zu lesen ist, bei der Bestimmung von Aromen und Fehlaromen in Getränken. In Kombination mit High-End-GC/MS-Systemen lässt sich der Informationsgehalt der sich ergebenden Daten deutlich vergrößern, etwa im Zuge der Verbindung von mSBSE mit hochauflösender GC/TOF-MS oder mittels derivat-SBSE mit anschließender GC/QQQ-MS-Analyse.

 

Literatur

[1] F. David, P. Sandra, J. Chromatogr. A 1152 (2007) 54
[2] F.M. Lancas, M.E.C. Queiroz, P. Grossi, I.R.B. Olivares, J. Sep. Sci. 32 (2009) 813
[3] C. Bicchi, E. Liberto, C. Cordero, B. Sgorbini, P. Rubiolo, LCGC NA (2009) 376
[4] Y. Nie, E. Kleine-Benne, GERSTEL AppNote 3/2011
[5] B. Sgorbini, C. Cagliero, C. Cordero, E. Liberto, P. Rubiolo, M. Rosanna, C. Bicchi, J. Chromatogr. A 1265 (2012) 39
[6] N. Ochiai, K. Sasamoto, T. Ieda, F. David, P. Sandra, J. Chromatogr. A 1315 (2013) 70
[7] K. Kumazawa, H. Masuda, J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 5169
[8] M. Kawakami, A. Kobayashi, K. Kator, J. Agric. Food Chem. 41 (1993) 633
[9] M. Meilgaard, A. Elizondo, E. Moya, MBAA Tech. Q. 7 (1970) 143
[10] N. Ochiai, K. Sasamoto, S. Daishima, A.C. Heiden, A. Hoffmann, J. Chromatogr. A 986 (2003) 101
[11] T. Kishimoto, A. Wanikawa, K. Kono, K. Shibata, J. Agric. Food. Chem. 54 (2006) 8855
[12] N. Ochiai, K. Sasamoto, T. Kishimoto, in preparation

 

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