Schematische Darstellung: Aufreinigung von Urinproben mittels DisposablePipetteExtraction (DPX) im Zuge der Bestimmung von Arzneimittelrückständen und deren Metaboliten.
Für die automatisierte Hydrolyse und DPX-Aufreinigung von Urinproben verwendeter GERSTEL-DualHead-MPS, der platzsparend oberhalb des verwendeten Agilent-6460-Triple-Quadrupol-MS montiert ist.
MPS-automatisierte Probenvorbereitung

Hydrolyse

MPS dosiert 75 μL internen Standard, 50 μL Glucuronidase und 250 μL eines 0,66 M Acetatpuffers (pH 4) in das Probenvial.
Transport des Vials auf geheiztes Tray, Inkubation der Lösung für 2 Stunden bei 55 °C.
Rückführung des Vials auf seinen ursprünglichen Platz.
Überführen einer 250-μL-Aliquote der hydrolysierten Urinprobe in ein sauberes Vial für die automatisierte DPX-Aufreinigung und Injektion.

DPX-Aufreinigung und Injektion

Ansaugen von 750 μL Acetonitril aus der Lösemittelstation mittels der 2,5-mL-DPX-Spritze.
Aufnehmen einer neuen DPX-Spitze (patentiertes Sorbens: DPX-RP-S) aus dem DPX-Tray.
Hinzufügen von 500 μL Acetonitril durch die DPX-Spitze in die Urinprobe auf dem MPS-Tray.
6 Sekunden Warten zwecks vollständiger Befeuchtung des DPX-Sorbens mit Acetonitril.
Ansaugen der gesamten Probe; Durchwirbeln von Probe und Sorbens mittels Ansaugen von 1400 μL Luft in die DPX-Spitze.
Nach einer Wartezeit von 5 Sekunden: Inhalt der DPX-Spitze sowie das in der DPX-Spritze überschüssige Acetonitril zurück in das Vorrats-Vial (Tray) pipettieren.
DPX-Spitze in Position „PipWaste“ bringen; DPX-Spitze verwerfen.
250 μL der oberen Flüssigkeitsschicht im Vorrats-Vial in ein neues 2-mL-Autosamplervial, verschlossen mit einer Septumkappe, überführen.
Den Extrakt verdünnen durch Hinzufügen von 250 μL 0,05 % Ameisensäure in Wasser in das Probenvial.
25 μL der verdünnten Probe in das HPLC-Injektionsventil injizieren.
LC/MS-Methodenparameter

HPLC

 
mobile Phase: A: 5 mM Ammoniumformiat in Wasser mit 0,05 % Ameisensäure
B: 0,05 % Ameisensäure in Methanol
LC-Pumpe: isokratisch, 50:50 (A:B) bei 0,3 mL/min
Laufzeit: 10 min
Injektionsvolumen: 2 μL (Schleifen-Überfülltechnik)
Säulentemperatur: 55 °C

MS

 
Betrieb: Elektrospray, positiver Modus, Ionenquelle: Agilent-Jetstream
Gastemperatur: 350 °C
Gasfluss (N2): 5 L/min
Nebulizer pressure: 35 psi
Sheath Gas Temp: 250 °C
Sheath Gas Flow: 11 L/min
Capillary voltage: 4000 V
Nozzle voltage: 500 V
Gute Linearität: Kalibrationsgeraden der Bestimmung von Morphin und Oxazepam nach automatisierter Hydrolyse und DPX-LC-MS/MS-Bestimmung von Morphin-3-glucuronid und Oxazepamglucuronid.
Overlay-Massenchromatogramm von Oxazepam: Es sind keine signifikanten Unterschiede ersichtlich, wenn der pH-Wert des 0,66-molaren Acetatpuffers zwischen 4,0 (A), 4,5 (B) und 5,0 (C) variiert.

Toxikologie

Schmerzmittel effizient und sensitiv in Harn bestimmen

Zahlreiche wertvolle Informationen über den Metabolismus von Medikamenten im Organismus lassen sich dem Harn mittels HPLC-MS/MS entnehmen, oft erst nach enzymatischer Hydrolyse der im Verlauf biotransformatorischer Prozesse entstandenen Stoffwechselprodukte. Üblicherweise ein aufwendiges, zeitintensives Prozedere, wird es von Hand ausgeführt, wie es weithin der Fall ist. Die Vorzeichen kehren sich um, wenn die Probenvorbereitung automatisiert und eine dispersive Festphasenextraktion (DPX) gewählt wird, wie nachfolgendes Beispiel zeigt.

Der Aufwand ist enorm, den Toxikologen in der Regel betreiben, um die Konzentration pharmakologisch wirksamer Verbindungen und deren Stoffwechselprodukte im Urin zu bestimmen. Als zeit- und arbeitsaufwendig erweist sich etwa die Hydrolyse der konjugierten Analyten in ihre Ausgangsform. Die Transformation erfolgt in der Regel enzymatisch, zum Beispiel unter Einsatz von β-Glucuronidase (GUSB). Um sicherzustellen, dass die Hydrolyse vollständig und reproduzierbar verläuft, ist eine Überwachung und Optimierung verschiedener Parameter erforderlich. Hierzu zählen der pH-Wert, die Temperatur sowie die Dauer der Hydrolyse in Abhängigkeit vom jeweiligen Enzym. Genannte Faktoren beeinflussen die Analyse nachhaltig. Gleiches gilt für störende Matrixkomponenten, die sich in nicht geringer Menge im Harn finden lassen. Um die für die Bestimmung von Arzneimittelwirkstoffen und deren Metaboliten geforderten niedrigen Detektionsgrenzen zu erreichen, sind Störstoffe aus der Matrix oder jene, die erst im Zuge der Hydrolyse als Nebenprodukte entstehen, zu eliminieren. Das geschieht in aller Regel unter Einsatz eines geeigneten Extraktionsverfahrens. In der forensischen Chemie weit verbreitet ist die Festphasenextraktion (SPE).

Attraktive Alternative zur SPE gefunden

Auf der Suche nach einer der klassischen SPE im Ergebnis vergleichbaren, wohl aber schnelleren Extraktionsmethode entwickelte der US-amerikanische Wissenschaftler William E. Brewer von der University of South Carolina die sogenannte Disposable Pipette Extraction (DPX). Hierbei handelt es sich folgerichtig um eine SPE-Technik, bei der die Extraktion nicht über ein in Kartuschen statisch eingebrachtes oder fixiertes Adsorbensmaterial verläuft. Bei der DPX wird die zu extrahierende Lösung in eine Pipettenspitze aufgezogen, in die das Sorbensmaterial locker eingelegt ist. Die Prozessführung sieht vor, Probe und Adsorbens miteinander zu verwirbeln, wobei die Probenlösung auf effiziente und schnelle Weise gereinigt wird beziehungsweise die Analyten extrahiert und angereichert werden.

Kennzeichen der DPX sind laut Erfinder und Anwendern eine schnelle Extraktion, hohe Wiederfindungsraten und vernachlässigbare Mengen einzusetzender und zu entsorgender Lösemittel. Obendrein „lassen sich die DPX sowie die nachfolgende Injektion des Extraktes in das Analysesystem automatisieren“, berichten Fred D. Foster und Kollegen [1]. Eben das haben die Applikationsexperten der in den USA ansässigen GERSTEL, Inc. gemeinsam mit William E. Brewer bei der Bestimmung von Schmerzmittelrückständen in Urin getan. Als Basis verwendeten die US-amerikanischen LC-Experten einen GERSTEL-DualHead-MultiPurposeSampler (MPS); mit diesem Autosampler lassen sich sowohl Extraktion, sprich: die Aufreinigung des Probenextrakts, als auch die Injektion einer Aliquote ins verwendete HPLC-System (Agilent 1290) ohne Spritzen- oder Instrumentenwechsel vornehmen.

Die Trennung der Zielanalyten Morphin, gebildet aus seinem hydrolisierten Konjugat Morphin-3-glucuronid, Oxazepam (Oxazepamglucuronid) und Oxymorphon (Oxymorphonglucuronid) erfolgte auf folgender Säule: Poroshell 120, EC-C18 (3,0 x 50 mm, 2,7 μm), die Detektion auf einem Agilent 6460 Triple-Quadrupol-MS mit Jetstream-Elektrosprayquelle. Zur Quantifizierung der Zielanalyten wurden deuterierte Analoga eingesetzt.

Vollständige Automatisierung sinnvoll und möglich

„Die Automatisierung von enzymatischer Hydrolyse, Extraktion und LC-MS/MSAnalyse ermöglicht die Bestimmung der im Urin enthaltenen Medikamentenwirkstoffe mit einem hohen Probendurchsatz.“ Zu diesem Ergebnis kommt Fred D. Foster [1] nach Abschluss und Auswertung der Methodenentwicklung. Der manuelle Aufwand ist verschwindend gering: Zunächst wird je eine 1-mL-Probe Urin von Hand in ein Autosamplervial pipettiert. Das Vial wird mit einer Kappe verschlossen und in das entsprechende Tray des Autosamplers gesetzt. Alle weiteren Schritte der Probenvorbereitung und Probenaufgabe verlaufen von da an automatisiert, gesteuert von der MAESTRO-Software.

Screenshot: MAESTRO-Prep-Sequenz-Scheduler während der Überwachung der automatisierten glucuronidasebasierten Hydrolyse

Fazit: Manuelle Methode erfolgreich automatisiert

Um den Verlauf der enzymatischen Hydrolyse von Urinproben mittels β-Glucuronidase bewerten und eine Vergleichbarkeit aufzeigen zu können, untersuchten Foster und Kollegen jeweils drei gleiche Urinproben, die mit 1000 ng/mL Oxazepamglucoronid dotiert waren, sowohl nach manueller als auch mittels automatisierter Hydrolyse-DPX-LC-MS/MS-Methode. Das Ergebnis besticht, wie Fred D. Foster deutlich macht: „Die Differenz beider Datensätze lag bei nur vier Prozent, das heißt: Wir haben eine gute Übereinstimmung erzielt.“

Um sicherzustellen, dass die automatisierte Hydrolyse vollständig verlief und innerhalb der automatisierten DPX-LC/MS/MS-Methode für die Quantifizierung von Analyten einsetzbar ist, wurden Standardlösungen und Urinproben mit Morphin-3-β-D-Glucuronid oder Oxazepamglucuronid dotiert und anschließend mittels der automatisierten DPX-LC-MS/MS-Methode bestimmt. Auch hier habe ihre Methode überzeugt, rekapituliert Fred D. Foster: „Da wir kein Signal für die glucuronid-konjugierten Analyten erhalten haben, können wir davon ausgehen, dass die Hydrolyse der zu analysierenden Urinproben vollständig verlaufen ist.“ Für eine erfolgreiche Methodenentwicklung sprächen auch die statistischen Parameter, die im Zuge der Analyse mit Morphin und Oxazepam dotierter Urinproben erzielt wurden. Die Richtigkeit habe im Durchschnitt für Morphin bei 102 %, für Oxazepam bei 96,3 % gelegen; die Präzision der Morphinbestimmung 3,52 % relative Standardabweichung (n=6), die von Oxazepam 4,70 %. Die Kalibration beider Analyten ergab R²-Werte von 0,99 oder größer.

 

Literatur

[1] F. D. Foster, J. R. Stuff, E. A. Pfannkoch, W. E. Brewer; "Automated Hydrolysis, DPX Extraction and LC/MS/MS Analysis of Pain Management Drugs from Urine" GERSTEL AppNote 01/2014
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