Chemische Struktur
von Rotundon
Zur Rotundon-Bestimmung nutzten Siebert und Barter ein vergleichbares GC/MS-System
Schemazeichnung der Membrane Assisted Solvent Extraction (MASE): Die semipermeable Membran hält Schwebstoffe fern (l.). Lösemittel wird zudosiert (M.); die Analyten diffundieren durch die Membran und der Extrakt für die anschließende GC/MS-Analyse wird von der Injektionsspritze aufgezogen.
Heart-cut-Chromatogramm des von Siebert und Barter in Shirazreben und -wein nachgewiesenen Rotundons.

Aromaanalytik

Auf Seelenfang im Weinberg

Rotundon ist ein Schlüsselaroma des australischen Shirazweines, sozusagen Herzstück seiner Seele. Zu wissen, wie Rotundon entsteht, kann wichtig sein, um den Weinanbau zu optimieren. Grundlegend ist ein effizientes Analyseverfahren. Das fanden Forscher in der Heart-cut-GC mit vorgeschalteter Membrane Assisted Solvent Extraction (MASE). Damit lassen sich Aromen effizient und sensitiv in matrixhaltigen Proben nachweisen.

Probieren geht über Studieren. Das gilt auch beim Wein. Um einen edlen Tropfen von einem minderwertigen Rebensaft unterscheiden zu können, ist ein bisschen Studieren allerdings ganz nützlich. Mitreden wollen fängt beim Vokabular an: Weinexperten nennt man Önologen, Spezialisten für guten Geschmack Sommeliers.

Und was fröhlichen Zechern die Weinprobe, zelebrieren Kenner klangvoll als Degustation. Doch auch Weinkenner stoßen an ihre Grenzen, wenn der Sinneseindruck nicht hinreicht, sondern Fakten gefragt sind. Die liefert im Fall des Weines mit seinen Hunderten flüchtige Aromen prägender Inhaltsstoffe die gaschromatographie mit massenselektiver Detektion (GC/MS). Ihrer bedienten sich auch Tracey E. Siebert und Sheridan R. Barter vom Australischen Weinforschungsinstitut in Glen Osmond (Adelaide). Zur Grundlagenforschung wohl gemerkt, nicht um die Sommeliers auf die Plätze zu verweisen. Sieberts und Barters Interesse galt der Antwort auf die Frage, wie Aromastoffe in der Traube entstehen, um Ansätze zu finden, den Anbau von Wein im Hinblick auf Geschmack und Bukett zu optimieren. Abgesehen hatten es die australischen Wissenschaftler auf das Rotundon, ein oxygeniertes, bicyclisches Sesquiterpen. Mit seinem charakteristischen Geschmackseindruck von schwarzem Pfeffer gilt Rotundon als Schlüsselaroma im australischen Shiraz, dem, bezogen auf die Menge, Primus unter den australischen Rebsorten. Die Shirazrebe wird als Edelrebe bezeichnet, gilt als ertragreich und hochwertig und recht unempfindlich gegenüber kälteren klimatischen Bedingungen. Letztgenannter Aspekt mag die weite Verbreitung rund um den Globus erklären; die Rebe wurde ursprünglich in Frankreich kultiviert (Syrah). Sie wird heute erfolgreich auch in Südafrika, den USA, Südamerika und Kanada sowie in Australien angebaut.

Einflussfaktoren auf dem Prüfstand

Der Reifeprozess der Rebe sei entscheidend für Qualität und Charakter des späteren Weines, heißt es. Allerdings verhelfe erst die Kenntnis jener Faktoren, die Einfluss auf Güte und Geschmack des Weines, also seine Seele, nehmen, zu einer genauen Vorstellung etwa davon, wie und in welcher Menge Rotundon in der Rebe gebildet werde oder wie sich der Weinanbau optimieren und eine von Jahrgang zu Jahrgang gleichbleibend hohe Weinqualität sicherstellen lasse. Um die Voraussetzungen dafür zu schaffen, braucht es ein effizientes, sensitives Analyseverfahren, sind Siebert und Barter überzeugt. Wie die beiden Wissenschaftler bei ihrer Arbeit vorgegangen sind, präsentierten sie auf dem 37th International Symposium for Capillary Chromatography im Mai 2013 im kalifornischen Palm Springs [1].

Das bislang verwendete Analyseverfahren erwies sich als zeit- und arbeitsaufwendig, bedingt den Einsatz großer Probenvolumina sowie eine umfangreiche Probenvorbereitung zur Abtrennung der Probenmatrix beziehungsweise Anreicherung des nur in geringen Konzentrationen vorliegenden Rotundons, bemerken Siebert und Barter und referieren aus der Literatur: Die Aroma-Nachweisgrenze von Rotundon liege bei 16 ng/L in Rotwein und 8 ng/L in Wasser. Eine Bestimmungsgrenze (Limit of Quantitation, LoQ) von < 8 ng/L sei erforderlich für Saft, Weintrauben, Maische und Wein, mit anderen Worten „für komplexe wässrige Proben, die Zucker, Ethanol, Anthocyane oder Polyphenole enthalten [2]“.

Erfolgsfaktor Extraktionsschritt

Als wesentlich für den Analyseerfolg bezeichnen Siebert und Barter folglich den Extraktionsschritt. Auf der Suche nach einer geeigneten Technik stießen sie auf die vom Umweltforschungszentrum Leipzig/Halle und GERSTEL in enger Kooperation entwickelten automatisierten Membrane Assisted Solvent Extraction (MASE). Bei dieser Variante der Flüssigflüssig-Extraktion dient eine semipermeable Membran als Phasengrenze, die Schwebstoffe und andere sehr polare, ionische und makromolekulare Matrixbestandteile zurückhält; weitere Probenvorbereitungsschritte wie Filtrieren oder Zentrifugieren erübrigen sich. Die MASE-Extrakte, auch jene stark matrixbelasteter Proben, sind sauber und lassen sich unmittelbar in ein GC(GC/MS)- oder LC(LC/MS)-System injizieren, berichten Siebert und Barter. Obendrein ermögliche die MASE die Handhabung von Proben-Lösemittel-Systemen, deren Phasen sich im Zuge einer klassischen Flüssig-flüssig-Extraktion nur schwer oder gar nicht trennen ließen, wodurch sich das Spektrum der analytischen Möglichkeiten erweitere [3, 4].

Probieren und studieren

Und so gingen die australischen Wissenschaftler vor: 100 Gramm Trauben wurden schonend vermengt und zentrifugiert. Die überstehende flüssige Phase wurde abgenommen und der feste Rückstand mit einem Ethanol-Wasser-Gemisch (60 mL) vermischt, geschüttelt und zentrifugiert; die Überstände wurden vereint und mit Wasser auf 200 mL aufgefüllt. 15 mL davon gelangten letztlich zur Analyse; alternativ wurde eine gleiche Menge Wein eingesetzt. Probenvorbereitung und Probenaufgabe wurden mittels eines GERSTEL-MultiPurposeSamplers (MPS) automatisiert ausgeführt; die MASE erfolgte mit 750 μL Hexan für die Dauer von 60 min. bei 35 °C. 100 μL (Large Volume) des resultierenden Extrakts wurden in den GC-Inlet (GERSTEL-Kalt-AufgabeSystem, KAS) des verwendeten Agilent GC 7890 injiziert. Die Trennung erfolgte über zwei Säulen (mehrdimensionale Heart-cut-GC), die Detektion mittels parallel geschaltetem MSD 5975C (im SIM-Modus, Selected Ion Monitoring) und FID (beide Agilent Technologies). Als interner Standard (IS) diente isotopenmarkiertes d4-Rotundon. Das beschriebene Verfahren, berichten Siebert und Barter, minimiere dank MASE und Large-Volume-Injektion den Aufwand der Probenvorbereitung deutlich. Probleme mit Interferenzen ließen sich kompensieren; die Abtrennung des interessanten Chromatogrammabschnitts mittels Heart-cut sowie die nachfolgende Chromatographie und Analyse über eine zweite Säule brachten ein klar definiertes Rotundon-Signal.

Das Analyseverfahren sei präzise, akkurat, robust und empfindlich – mit einer Bestimmungsgrenze im ppt-Bereich – und führe zu einem hohen Probendurchsatz, bestätigen die Wissenschaftler. Für die Güte ihres Verfahrens spreche die Statistik: „Sowohl in Shiraztrauben (0 bis 2000 ng/L) als auch im Wein (0 bis 500 ng/L) betrug die kleinste quantitativ zu bestimmende Konzentration (Limit of Quantitation, LOQ) 5 ng/L, der Korrelationskoeffizient (r2) lag über 0,999 und die Wiederholbarkeit zeigte mit einer relativen Standardabweichung von unter 3 % (n=6) bei niedrigen wie auch hohen Rotundon-Konzentrationen einen guten Wert“, berichten Siebert und Barter. Mit dem hier beschriebenen Verfahren habe man die Grundlage geschaffen, schlussfolgern die Weinforscher, im Detail unter anderem untersuchen zu können, wie Rotundon in der Traube gebildet wird, was den Bildungsprozess auslöst oder wie Hefe die Extraktion beeinflusst. Dieses Wissen könne hilfreich sein, sind Siebert und Barter überzeugt, „Wege zu finden, die Rotundon-Bildung in der Traube und seine Konzentration im Wein zu kontrollieren“.

Weitere Untersuchungen sowie eine Publikation der gesamten Forschungsergebnisse in einem wissenschaftlichen Journal stehen an.

 

Literatur

[1] Siebert, T. E. and Barter, S. R. "Determination of the potent flavour compound rotundone in grapes and wine using MDGC-MS and membrane assisted solvent extraction." Posterpräsentation, 37th International Symposium for Capillary Chromatography (2013) Palm Springs, USA.
[2] Wood, C.; Siebert, T. E.; Parker, M. et al.: "From Wine to Pepper: Rotundone, an Obscure Sesquiterpene, Is a Potent Spicy Aroma Compound" J. Agric. Food Chem. 56 (2008) 3738-3744
[3] Schellin, M. and Popp, P. "Membrane-assisted solvent extraction of polychlorinated biphenyls in river water and other matrices combined with large volume injection, gas chromatography, mass spectrometric detection" J. Chromatogr. A. 1020
(2003) 153–160