Elektronenstoß-(Electron Impact, EI)-Spektrum einer 5-ng-Direktinjektion von 2,4,6-Trichloranisol. Das molekulare Ionencluster erscheint bei m/z=210 (M), 212 (M+2) und 214 (M+4). Das Hauptcluster bei m/z=195 (M) ist das Methylverlust-Peakcluster. Aufgrund verschiedener Siloxan-Interferenzen ist die Isotopenverteilung für die drei im Molekül enthaltenen Chloratome nicht zu erkennen.
Elektronenstoß-NIST-Bibliotheksspektrum von 2,4,6-Trichloranisol (# 333450). Das molekulare Ionencluster erscheint bei m/z=210 (M), 212 (M+2) und 214 (M+4) und zeigt die zu erwartende Isotopenverteilung eines organischen Moleküls mit drei Chloratomen an.
„Collision inducted dissociation“-(CID)-Spektrum von 2,4,6-Trichloranisol mit Vorläuferion m/z=210 (M).
Extraktionseffizienz im Blick
Wie gut sich Analyten mit der SBSE mittels PDMS-Twister extrahieren lassen, lässt sich anhand des Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (Ko/w) bestimmen. Hierbei handelt es sich um einen dimensionslosen Wert, der das Verhältnis der Konzentration einer Chemikalie in einem Zweiphasensystem, bestehend aus 1-Octanol und Wasser, angibt. Der Ko/w dient dazu, die hydrophoben beziehungsweise hydrophilen Eigenschaften einer Chemikalie zu beschreiben [4]. Der Logarithmus des Ko/w einer Substanz lässt Schätzungen über ihr Verteilungsverhalten in einem PDMS-Wasser-System zu. Ein großer Log Ko/w-Wert steht für hohe Hydrophobizität, die betreffende Substanz sorbiert sehr gut im PDMS und lässt sich mit entsprechend hoher Wiederfindung mit dem GERSTEL-PDMS-Twister extrahieren.
Agilent 7000B Triple-Quadrupol-GC-MS-System mit 7890A Gaschromatograph. Die Einheit beinhaltet einen GERSTEL-MPS-Autosampler (Dual-Rail-System), Schüttelinkubator, MultiFiberExchange (MFX), ThermalDesorptionUnit (TDU) mit Twister-Option, SPME-Faser-Ausheizstation und Dynamische Headspace-Option (DHS).

Pharmaanalytik

Miefige Tabletten - nein danke!

Medikamente, die unangenehm riechen, mögen uneingeschränkt wirksam und verträglich sein, verunsichern aber den Patienten, der einen schlechten Geruch mit minderwertiger Qualität gleichsetzt. Das Präparat landet vermutlich im Müll, und dem Hersteller haftet im Zweifel ein schlechtes Image an. Dieses Szenario ist für beide Seiten, Hersteller wie Verbraucher, alles andere als wünschenswert. Um Fehlgerüchen in Pharmazeutika und Pharmaverpackungen nachzuspüren, haben US-amerikanische Wissenschaftler ein hochsensitives GC-MS/MS-Verfahren mit vorangehender Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) entwickelt und validiert.

In puncto Qualitätskontrolle ist Mutter Naturs evolutionäres Konzept kaum zu toppen. Alles, was wir oral zu uns nehmen, tangiert unweigerlich, anatomisch gar nicht anders möglich, unsere Nase und wird, im Zuge der Einführung in den Mund beziehungsweise im Mund selbst über den Gaumen, einer sensorischen Sondierung unterzogen. Die Konsequenzen dieser Geruchsvermessung sind unmittelbar spürbar: Von allem, was gut riecht, bekommen wir die Nase nicht voll genug; ein fieser Geruch hingegen löst einen neuronalen Alarm aus: Wir rümpfen die Nase, ekeln uns, lehnen das Gereichte ab.
Blickt man auf das große Ganze, stellt sich heraus: Die olfaktorische Nasenbewertung spielt für uns eine wichtige Rolle. Wie Evolutionsbiologen herausfanden, führte vor allem die Erweiterung des Riechzentrums zu einem Ausbau des gesamten Säugetiergehirns [1].

Der Nasenfaktor ist entscheidend

Es scheint offenkundig zu sein: Der Weg zum Verbraucher führt über dessen Nase. Produkte, die der oralen Applikation dienen, sollten duften beziehungsweise neutral riechen. Das gilt für Nahrungs- und Genussmittel ebenso wie für Medikamente. Weil aber bereits winzige Mengen olfaktorisch relevanter Verunreinigungen unseren feinen Geruchssinn in Alarmbereitschaft versetzen können, bedarf es einer sehr sensitiven Analytik wie der Gaschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektroskopie (GC-MS/MS), um eventuelle Fehlgerüche (off odors) auch in den niedrigsten wahrnehmbaren Konzentrationen (Stichwort: Geruchsschwellenwert) sicher zu identifizieren – idealerweise bevor eine Partie des kontaminierten Produkts in den Handel gelangt, damit es nicht, wie die Praxis zeigt, zu einer kostspieligen, imageschädigenden Rückrufaktion kommt.
Vor zwei Jahren sah sich ein in den USA ansässiges, international tätiges Pharmaunternehmen gezwungen, Zehntausende von Fläschchen unterschiedlicher Medikamente vom Markt zu nehmen, weil sich Verbraucher über einen den Präparaten anhaftenden modrigen Geruch beschwert hatten, der Weinkennern ein alter Bekannter ist und der als Korkschmecker oder Korker bezeichnet wird. Ursächlich für diesen Fehlgeruch sind sogenannte Haloanisole beziehungsweise Halophenole. Zu der Verbindungsklasse zählen: 2,4,6-Trichloranisol (TCA), 2,4,6-Tribromanisol (TBA) und 2,3,4,6-Tetrachloranisol (TeCA) beziehungsweise 2,4,6-Trichlorphenol (TCP), 2,4,6-Tribromphenol (TBP) und Pentachlorphenol (PCP). Der Geruchsschwellenwert, also die geringste Konzentration eines gasförmigen, sensorisch aktiven Stoffes, die der Mensch gerade noch wahrnehmen kann, liegt etwa – bleiben wir einmal beim Wein – für TCA bei 1,4-4 ng/L, für TBA bei 3-8 ng/L und für TeCA bei 4-24 ng/L [3], für TCP und PCA bei rund 4000 ng/L [2,3].

Korkschmecker und seine Ursachen

Kleine fachliche Exkursion gefällig? Ihren Eintrag in den Wein finden Haloanisole und Halophenole klassischerweise über den Korken, hergestellt aus der Rinde der Korkeiche. Wie bekannt ist, entstehen die Korkschmecker durch eine mikrobiell induzierte Methylierung von Trichlorphenol (TCP), das als Bestandteil von Pflanzenschutzmitteln der Korkeichenrinde anhaftet. Seitdem man aber festgestellt hat, dass auch der Inhalt von Weinflaschen, die mit einem Kunststoffkorken verschlossen sind, vom Korkschmecker befallen sein kann, weiß man, dass für den modrigen Fehlgeruch auch andere Ursachen und Quellen in Frage kommen.
Bis Ende der 1980er-Jahre wurde das Fungizid Pentachlorphenol (PCP) eingesetzt, etwa um Holzpaletten vor einer mikrobiellen Zersetzung zu schützen. Als Verunreinigung enthielt PCP unter anderem 2,3,4,6-Tetrachlorphenol (TCP), eine Verbindung, die von Mikroorganismen zu 2,3,4,6-Tetrachloranisol (2,3,4,6-TeCA) umgebaut wird und die, wie oben beschrieben, im Wein Korkgeschmack verursachen kann. PCP erwies sich im Tierversuch allerdings als kanzerogen; sein Einsatz ist hierzulande seit 1989 verboten. Substituiert wurde PCP durch das 2,4,6-Tribromphenol (TBP), eine Verbindung, die fungizid und flammenhemmend wirkt, daher auch gern Kartonagen, Kunststoffen und Anstrichfarben als Additiv zugesetzt wird. Wie man nun weiß, verstoffwechseln Mikroorganismen TBP zu 2,4,6-Tribromanisol, einer Verbindung, die sensorisch ebenso mit Attributen wie muffig, erdig, chemisch, nach Lösemitteln riechend beschrieben wird. [3] Mit anderen Worten handelt es sich auch beim TBP um einen Korkschmecker erster Güte. Eben diese Verbindung brachte die in den USA zurückgerufenen Medikamente olfaktorisch in Misskredit. Die Kontamination der Arzneimittel mit 2,4,6-TBA, wurde damals spekuliert, entstammte vermutlich einem Holzimprägnierungsmittel, das bei der Herstellung von Transportpaletten verwendet wurde. Der Fehlgeruch gelangte im Zuge von Lagerung und Transport über die Verpackung ins Medikament.
Wer sich der Ursachen zweifelsfrei gewahr ist, kann für Abhilfe sorgen. Das dachten sich wohl die mit der Aufklärung der Geruchsbelastung von Medikamenten befassten US-amerikanischen Wissenschaftler und machten sich daran, eine entsprechend hochsensitive GC-MS/MS-Methode zum quantitativen Nachweis von 2,4,6-TCA, 2,4,6-TBA, 2,4,6-TBP und 2,4,6-TCP in Tabletten sowie 2,4,6-TBA in Verpackungsmaterialien zu entwickeln und zu validieren [3].

Auf der Suche nach der geeigneten Extraktionstechnik

Bei der Methodenentwicklung im Blick hatten Gyorgy Vas und Kollegen von Johnson and Johnson sowie von McNeil Consumer Healthcare insbesondere ein leistungsstarkes Extraktionsverfahren; schließlich ging es darum, unterschiedlich volatile Spurenverbindungen hinreichend sensitiv zu quantifizieren. Im Zuge ihrer Literaturrecherche stellten die Wissenschaftler fest, dass zur Anreicherung der relativ flüchtigen Haloanisole häufig Headspace-basierte (HS) Methoden in Verbindung mit der Festphasenmikroextraktion (SPME) zur Anwendung kommen. „Die HS-SPME besitzt gegenüber etwa Flüssigextraktionsmethoden den Vorteil“, schreiben die Wissenschaftler im Journal of Chromatography A [3], „dass sie leicht zu automatisieren, einfach durchzuführen und auf eine große Bandbreite flüchtiger Verbindungen anzuwenden sind“. Zu beklagen sei jedoch die oftmals geringe Extraktionseffizienz aus festen und flüssigen Proben. Um auch geringer flüchtige Komponenten analysieren zu können, präferierten die Forscher die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) mit dem GERSTEL-PDMS-Twister, der über eine signifikant größere Menge an Sorptionsphase verfügt: „Die SBSE erweist sich als sehr effektiv beim Nachweis von Spurenkomponenten, da die Extraktionsphase (des Twisters) gegenüber der SPME relativ groß ist“, begründen Vas und Kollegen ihre Entscheidung. Darüber hinaus hatte sich die SBSE bei der Bestimmung von Korkschmeckern in Wein bereits bewährt [2].

Der Weg der Methodenentwicklung

Vas und Kollegen entwickelten ihre Methode unter Einsatz von Standardlösungen (Konzentration der Haloanisole: 20, 40 und 200 pg/μL, der Halophenole: 500, 1000 und 2000 pg/μL; 100 pg/μL d5-TBA) an rezeptfrei erhältlichen Tabletten unterschiedlicher Gewichte sowie diversen Verpackungsmaterialien, namentlich Karton, Polyethylen, Polycarbonat und Palettenholz. Die Quantifizierung der Zielkomponenten wurde unter Einsatz von deuteriertem 2,4,6-d5-Tribromanisol vorgenommen. Die Komponenten wurden mittels Tandem-MS-Detektion identifiziert und quantifiziert (Multiple Reaction Monitoring, MRM). Folgende Massenübergänge wurden für die verschiedenen Analyten beobachtet:

TBA 346 -> 331 (quantifier) and 346-> 303 (qualifier)
TCA 212 -> 197 (quantifier) and 212 -> 169 (qualifier)
TCP 196 -> 132 (quantifier) and 196 -> 160 (qualifier)
TBP 330 -> 222 (quantifier) and 330 -> 250 (qualifier)
d5-TBA 349 -> 331 (quantifier)

Die Validierung von Methode und Verfahren führten US-Wissenschaftler gemäß der „ICH Q2 (R1)“-Richtlinie (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) und den Vorgaben der Food and Drug Administration (FDA) durch. „Da diese Richtlinie nicht vollständig die analytische Validierung von Methoden zur Bestimmung von Spurenmengen umfasst und weil TCP ein Herbizid ist, folgten wir bezüglich der Durchführung der Analysemethode und Auswertung der Messergebnisse der Richtlinie 96/23/EG (Entscheidung 2002/657/EG der Kommission vom 14. August 2002)“, schreiben die Wissenschaftler.
Bei dem verwendeten GC-MS/MS-System handelte es sich um ein Agilent 7000B Triple-Quadrupol-GC/MS-System (mit GC 7890), beim GC-Einlass um ein GERSTEL-KaltAufgabeSystem (KAS) zur Cryofokussierung und temperaturprogrammierten Aufgabe der Analyten auf die Säule (DB-5 MS, UI, 20 m, 0,18 mm, 0,36 μm); dem KAS saß eine GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU) auf, die der Desorption des GERSTEL-Twisters (10 mm lang, PDMS: 1,0 mm Schichtdicke) dient. Die Probenaufgabe erfolgte automatisiert mit einem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS).
Jeweils vier Tabletten wurden in einem Probengefäß in einer wässrigen, ameisensauren (0,1 %) Lösung mit 5 μL Standardlösung und dem deuterierten internen Standard versetzt und für 30 min ins Ultraschallbad gestellt, anschließend erfolgte für die Dauer von 90 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute die SBSE der Zielanalyten. Der PDMS-Twister wurde jeder Probe entnommen, trocken getupft und zur Thermodesorptionsanalyse in Glasröhrchen überführt, die auf dem MPS-Autosampler platziert wurden. Die GC-MS/MS-Analyse schloss sich an.
Das zu untersuchende Verpackungsmaterial wurde in Form quadratzentimetergroßer Stücke zerteilt und im Vial mit 100 pg/g 2,4,6-TBA versetzt. Die Probengefäße wurden verschlossen und blieben für die Dauer von 48 Stunden ungeöffnet, um „dem TBA hinreichend Zeit zu geben, die Matrix zu durchsetzen und von ihr absorbiert zu werden“, schreiben Vas und Kollegen. Etwa eine Stunde vor dem Ultraschallbad wurde der interne Standard zugesetzt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Probe in ein 125-mL-Vial überführt, mit 100 mL einer Wasser- Aceton-Mischung versetzt, 30 min im Ultraschallbad extrahiert und anschließend für die Dauer von 90 min mit dem GERSTEL-Twister bei 1000 Umdrehungen pro Minute durchmischt. Die PDMS-Twister wurden daraufhin entnommen, trocken getupft und für die anschließende automatisierte GC-MS/MS-Bestimmung in Glasröhrchen überführt und auf dem MPS platziert.

Was zu sagen übrigbleibt

Vas und seinen US-amerikanischen Kollegen ist es gelungen, ein „GC-MS/MS-basiertes Verfahren mit vorausgehender SBSE (PDMS-Twister-Extraktion) für die Quantifizierung von TCA, TCP, TBA und TBP in Feststoffarzneimitteln zu entwickeln und zu validieren“ [3]. Das SBSE-GC-MS/MS-Verfahren wurde als Standardadditionsmethode für die Untersuchung von Arzneimitteln, die mit den beschriebenen Zielanalyten kontaminiert sind, validiert. Die validierte Bandbreite beträgt für die beschriebenen Haloanisole 1000 pg pro Tablette und für die Halophenole 2.500-10.000 pg pro Tablette. Die Nachweisgrenze (absolute Menge) lag für TCA bei 4 pg, für TCP bei 286 pg, für TBA bei 9 pg und für TBP bei 371 pg. Für die Wiederfindung wurden, je nach Formulierung, folgende Werte erzielt: 79-97 % für TCA, 67-89 % für TCP, 68-76 % für TBA und 56-72 % für TBP; eingesetzt wurden je 100 pg der Haloanisole und je 2500 pg der Halophenole. Die Präzision der wiederholten Messung derselben Proben, ausgeführt auf demselben Gerät, vom selben Nutzer und am selben Tag, ergab folgende relative Standardabweichungen (RSD) in Prozent: 6,2-11,3 für TCA, 3,2- 12,9 für TCP, 3,1-11,0 für TBA und 6,5-15,6 für TBP; die Messung erfolgte gegen deuteriertes Tribromanisol (d5-TBA) als internen Standard.

 

Literatur

[1] Timothy B. Rowe, Thomas E. Macrini, and Zhe-Xi Luo, Fossil Evidence on Origin of the Mammalian Brain, Science 20 (2011) 955- 957.
[2] G. Deußing, Korkgeschmack analytisch betrachtet, LaborPraxis 12 (2010) 34-36.
[3] Jiun-Tang Huang, Lori Alquier, Joyce P. Kaisa, Gail Reed, Timothy Gilmore, and Gyorgy Vas, Method development and validation for the determination of 2,4,6-tribromoanisole, 2,4,6-tribromophenol, 2,4,6-trichloroanisole, and 2,4,6-trichlorophenol in various drug products using stir bar sorptive extraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry detection, Journal of Chromatography A 1262 (2012) 196-204.
[4] G. Deußing, (Nimm zwei)² , GERSTEL Aktuell 44 (2011) 18-20