GERSTEL-GC/MS-Komplettsystem ausgestattet mit der DualTower-Variante des GERSTEL-MPS und der Multi-Position Evaporation Station (mVAP)
Probenvorbereitung

Für die MPS-SPE verwendet wurde eine M&N-C18ec-Säule, 1 mL, 100 mg. Das automatisierte SPE-Prozedere gestaltete sich bis zur Probenaufgabe wie folgt:

Konditionieren der Säule mit Methanol, Wasser und Essigsäure
Aufgabe von nur 0,5 mL Serumprobe
(versetzt mit 0,5 mL Essigsäure und
internem Standard)
Waschen der Säule mit Essigsäure sowie einem Acetontiril-(ACN)-Wasser-Gemisch (40/60)
Trocknen des Säulenbetts mit Stickstoff
Elution mit 400 µL Acetonitril (ACN)
Eindampfen bei 60 °C bis zur Trockene mittels mVAP
Aufnehmen des Rückstands mit 25 µL MSTFA bei Raumtemperatur
Injektion von 3 µL in den Split/splitless-Injektor des GC mit Inlet-Derivatisierung.
Die Trennung erfolgte in einem Agilent GC 6890 über eine Kapillarsäule (VF-1 ms 25 m x 0,2 mm x 0,33 µm, Agilent) und die Detektion mit einem Agilent MSD 5973 im
Single-Ion-Monitoring (SIM).
Standard-Kartusche für die Festphasenextraktion (unten) im Vergleich zum GERSTEL-Format für automatisierte SPE. Die Verfügbarkeit ist gewährleistet dank zahlreicher Anbieter wie Agilent Technologies, Sigma-Aldrich, Macherey & Nagel.
Schematische Darstellung der automatisierten GERSTEL-SPE.
Daten der Validierung gemäß den Vorgaben der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh).
Nachweis von THC und seiner Metaboliten aus Serum mittels automatisierter SPE. Die Extraktion von 0,5 ml Serum erfolgte mit einer 1-mL-SPE-Kartusche (100 mg C18ec); 1 mL Serum wurde mit einer 3-mL-Kartusche (200 mg C18ec) extrahiert. Das getrocknete Eluat wurde in 25 µL MSTFA bzw. 40 μL MSTFA aufgenommen. Beide Versuche führten zu vergleichbaren Ergebnissen, allerdings benötigte die 1-mL-Kartusche weniger: Probe, Lösemittel, Elutionsvolumen, Zeit für die Verdampfung, MSTFA, Zeit für die Probenvorbereitung. Im Gegenzug aber trug ihre Verwendung zu einem höheren Probendurchsatz bei.
Danksagung

Die GERSTEL GmbH & Co. KG dankt Dr. Gertrud Rochholz, Dr. Hans-Werner Schütz und Lars Radünz vom Institut für Rechtsmedizin der Universitätsklink Schleswig-Holstein in Kiel für die hervorragende Zusammenarbeit bei der Entwicklung und Validierung der hier vorgestellten Methode.

Autor

Dr. Oliver Lerch,
GERSTEL GmbH & Co. KG
Kontakt: oliver_lerch@gerstel.de

Forensische Toxikologie

Kiffer auf der Fahndungsliste

In Kooperation mit dem Institut für Rechtsmedizin der Universitätsklinik Schleswig-Holstein in Kiel hat GERSTEL die bislang am Institut manuell durchgeführte Bestimmung des Cannabiswirkstoffs Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) und seiner Metaboliten 11-Hydroxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-OH) und 11-nor-9-carboxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-COOH) in Serum vollständig automatisiert. Das Resultat einer effizient automatisierten Cannabis-Analytik, eine Gemeinschaftsentwicklung von Toxikologen und Experten des Unternehmens, kann sich sehen lassen.

Cannabis gehört zu den populären Drogen und wird daher relativ häufig bei Straßenverkehrsdelikten gefunden, die in Zusammenhang mit der Einnahme berauschender Mittel stehen. Der Cannabis-Nachweis ist Teil der forensisch-toxikologischen Praxis. Verkehrsteilnehmer, die mit einem Wert von größer 1 ng/mL des Cannabiswirkstoffs Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) im Blut erwischt werden, müssen in Deutschland nicht nur mit einem Bußgeld rechnen, sondern auch damit, ihre Fahrerlaubnis zu verlieren. Ob der Verlust temporär oder von Dauer ist, hängt vom Konsumverhalten des Delinquenten ab.

Konsumverhalten ist entscheidend

Entscheidungen, die zu einem dauerhaften Entzug der Fahrerlaubnis führen, werden nicht leichtfertig getroffen. Wesentlich ist die Faktenlage, also: der tatsächliche Drogenkonsum respektive inwieweit von einer regelrechten Abhängigkeit gesprochen werden kann. Die Ermittlung wesentlicher beziehungsweise gerichtsrelevanter Fakten erfolgt im toxikologischen Labor, das sich hierzu den natürlichen Stoffwechsel des Cannabiswirkstoffs THC zunutze macht:
Ein hoher Wert an Δ9-Tetrahydrocanna-binol im Blut lässt auf eine akute Intoxikation schließen, vergleichbar dem Promillewert, den die Polizei im Rahmen von Atem- oder Blutalkoholkontrollen ermittelt. Der Nachweis von 11-Hydroxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-OH) insbesondere auch im Urin kann auf einen kürzlich zurückliegenden Cannabiskonsum hindeuten, jener von 11-nor-9-carboxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-COOH) auf einen gelegentlichen (> 75 ng/mL THC-COOH im Serum) beziehungsweise regelmäßigen (> 150 ng/mL THC-COOH im Serum). Das offenkundige Abhängigkeitsverhalten führt in der Regel zu einem dauerhaften Entzug der Fahrerlaubnis in Verbindung mit einer medizinisch-psychologischen Untersuchung, umgangssprachlich auch
„Idiotentest“ genannt.

Manuelle SPE-GC/MS-Bestimmung als Standardverfahren

Am Institut für Rechtsmedizin der Universitätsklinik Schleswig-Holstein in Kiel erfolgte der Nachweis von THC, THC-OH und THC-COOH u. a. aus Serum mittels Gaschromatographie, gekoppelt an eine massenselektive Detektion nach vorangegangener Festphasenextraktion (SPE-GC/MS). Das Prozedere der Messung lässt sich in Kürze wie folgt beschreiben: 1 mL Serum wurde mit 1 mL Essigsäure sowie deuterierten Analoga der drei Analyten als interne Standards versetzt.
Die Extraktion der Probenlösung  erfolgte anschließend auf einem ASPEC-System (Gilson) über Reversed-phase-Kartuschen von UCT (C18ec, 3 mL, 200 mg). Das Eluat wurde in einem weiteren Schritt eingedampft und der Rückstand mit dem Derivatisierungsmittel N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (MSTFA) aufgenommen. Die Derivatisierung der Analyten erfolgte sodann im Inlet des Split/splitless-Injektors und deren Bestimmung auf einer GC/MS-Gerätekombination von Agilent Technologies im Single-Ion-Monitoring-Modus (SIM).
Alles in allem ein funktionierendes, jedoch aufwendiges Prozedere, das viele manuelle Zwischenschritte und Handgriffe erforderte sowie den Einsatz vergleichsweise großer Mengen Lösemittel und Serum. In Kooperation mit dem Institut für Rechtsmedizin automatisierte GERSTEL die bestehende SPE-GC/MS-Methode, wobei weiteres Optimierungspotenzial erschlossen wurde.

Entwicklung einer automatisierten SPE-GC/MS-Methode

Da die Serumproben weiterhin einer Festphasenextraktion (SPE) unterzogen werden sollten, kam eine Automatisierung der Probenvorbereitung auf dem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS) unter Einsatz der SPE-Option in Betracht, die eine geradezu Eins-zu-eins-Umsetzung der manuellen Arbeitsschritte auf den Laborroboter ermöglicht – unter den Vorzeichen einer höheren Präzision und Verlässlichkeit des Arbeitsablaufes (siehe Schema der SPE, S. 15). Attribute, die im Zuge der manuellen Handhabung und  in Abhängigkeit von der Erfahrung des Anwenders gewissen Schwankungen unterliegen können. Die MAESTRO-Steuersoftware des MPS erlaubt dem Anwender, sämtliche erforderlichen Arbeitsschritte und -abläufe bequem aus einem übersichtlichen Menü per Mausklick zusammenzustellen und intuitiv zu modifizieren.
Dies beinhaltet nicht allein die SPE, sondern alle bisher durchgeführten Probenvorbereitungsschritte. Der MPS dampft das Eluat im integrierten GERSTEL-mVAP bei 60 °C ein; der Rückstand wird automatisiert mit MSTFA aufgenommen und ein Aliquot ins GC/MS-System injiziert.

Details der automatisierten SPE bis zur Probenaufgabe

Da die SPE-Option des MultiPurposeSamplers (MPS) angepasste Standard-SPE-Kartuschen erfordert, wurde in einem Test der bisher genutzten UCT-Säule alternativ ein gleicher Säulentyp (Macherey & Nagel, C18ec, 3 mL, 200 mg) gegenübergestellt. Dieser Vergleich erbrachte ähnliche Leistungen für beide Säulen. Da geringere Proben- und Lösemittelvolumen Verwendung finden sollten, war zu vermuten, dass der Einsatz einer gleichen M&N-Säule, jedoch von geringerer Dimension, ebenso vielversprechende Resultate liefern würde. Die Annahme wurde experimentell bestätigt (siehe Chromatogramm).

Transfer der manuellen in die automatisierte Arbeitsweise

Jede Methode ist nur so gut, wie sie sich in der Praxis bewährt. Im vorliegenden Fall gelang die Übertragung der am Institut für Rechtsmedizin der Universitätsklinik Schleswig-Holstein manuellen SPE-GC/MS-Bestimmung von THC und dessen Metaboliten THC-OH und THC-COOH auf ein vollständig automatisiertes System. Die eingangs gesteckten Ziele wurden  erreicht: Reduziert wurde das einzusetzende Proben-, sprich Serumvolumen von 1 auf 0,5 mL, ebenso die Dimension der SPE-Säule wie auch die Menge der einzusetzenden Lösemittel; nicht nur die Kosten pro Analyse ließen sich senken, sondern auch der manuelle Aufwand, was zu einer nachhaltigen Effizienzsteigerung des Labors beiträgt. Zu den Bewertungskriterien der Güte einer Analysenmethode: Die Bestimmungsgrenze von THC und THC-OH in Serum lag bei < 1 ng/mL. Die Kalibration verlief über einen weiten Konzentrationsbereich eindeutig linear. Die Wiederholbarkeit der Messung in Bezug auf alle drei Verbindungen lag im Schnitt bei 5 Prozent, die Wiederholbarkeit von Tag zu Tag im Schnitt bei 9 Prozent. Die Extraktionseffizienz erreichte Werte zwischen 70 und 93 Prozent. Verschleppungen (Carryover) von Probe zu Probe wurden nicht festgestellt. Neben diesen für die Methodenentwicklung sicherlich überaus wichtigen Aspekten, existieren für uns als Entwickler und Gerätelieferanten weitere Kriterien, die zu erfüllen sind, will man von einem Erfolg sprechen:

1. Die validierte SPE-GC/MS-Methode zum Nachweis von THC, THC-OH und THC-COOH entspricht den Anforderungen der forensisch-toxikologischen Praxis.

2. Weitere rechtsmedizinische Institute haben ihr Interesse an der Methode bekundet. 3. Das SPE-GC/MS-System taugt nicht allein für den Nachweis der genannten Verbindungen, sondern bietet Toxikologen obendrein ein weites Feld zusätzlicher Möglichkeiten.