Zur AMPA/Glyphosat-Analyse
eingesetztes MPS-SPEXOS-HPLC-MS/MS-System.
Laden der SPExos-Kartusche
Konditionieren der Kartusche
mit 1 mL Methanol
Spülen der Kartusche mit 2 mL Wasser 

Aufgabe von 1000 µL Probe

Waschen der beladenen Kartusche
mit 1100 µL Wasser 

Direkte Elution der Analyten in den Eluentenstrom des HPLC-Systems
Elution und Derivatisierung
der nachfolgenden Probe
Sämtliche Schritte verliefen automatisiert. Nach 25 Minuten war die Probenvorbereitung abgeschlossen; Zykluszeit der HPLC-MS/MS-Analyse: 20 Minuten.
Die SPExos-Schritte verliefen synchron mit dem GERSTEL-MPS. Gesteuert wurde das System mittels GERSTEL-MAESTRO-Software, angebunden an die MassHunter-Software von Agilent Technologies
1 ng/mL Glyphosatstandard nach Derivatisierung mit FMOC.
0,5 ng/mL AMPA-Standard nach Derivatisierung mit FMOC.
Überlagerung der Chromatogramme von gemessenen Glyphosatstandards (0,1, 0,5, 1,0 und 5,0 ng/mL) nach Derivatisierung mit FMOC und Aufreinigung des Extrakts.
Überlagerung der Chromatogramme von gemessenen AMPA-Standards (0,1, 0,5, 1,0 und 5,0 ng/mL) nach Derivatisierung mit FMOC und Aufreinigung des Extrakts.
Überlagerung der Chromatogramme von Glyphosat (oben) und AMPA (unten) in Weizen (0,01 und 0,1 mg/kg) nach Derivatisierung mit FMOC und Aufreinigung des Probenextrakts.
Kalibration der Analyse von Glyphosat-FMOC-Derivaten.
Kalibration der Analyse von AMPA-FMOC-Derivaten.
Autoren

Dr. Norbert Helle, Franziska Chmelka,
TeLA GmbH, Fischkai 1,
27572 Bremerhaven,
Telefon 0471 / 4832 430,
www.tela-bremerhaven.de

Herbizidanalytik

Apropos Glyphosat

Die US-Firma Monsanto bezeichnet Glyphosat als das meistverkaufte Pflanzenschutzmittel weltweit. Eingesetzt werden glyphosathaltige Herbizide sowohl in der Landwirtschaft, etwa um Äcker vor der Neuaussaat zu säubern, als auch im heimischen Umfeld. Die Häufigkeit, mit der Glyphosat auf Felder und in Gärten ausgebracht wird, macht eine Kontrolle von Agrargütern auf Rückstände des Herbizids notwendig. Zur Bestimmung mittels HPLC-MS/MS bedarf es der Derivatisierung des Glyphosats; Effizienz und Sensitivität der Analyse lassen sich durch Automatisierung steigern.

Unangesehen der Diskussion über die Toxizität, aller Forderungen und Pläne hinsichtlich eines künftigen Umgangs mit Glyphosat und einer Neubewertung des Unkrautvernichtungsmittels steht eines doch uneingeschränkt fest: Das Wohl des Verbrauchers ist als höchstes Gut zu schützen und zu bewahren. Pestizid- und Herbizidrückstände gehören weder in Lebensmittel, noch sollten sie über Grund- und Oberflächengewässer ins Trinkwasser gelangen, gleichgültig ob ein tatsächliches Gefährdungspotenzial festgestellt wurde oder ob es nur vermutet wird. Gewissheit und damit die Voraussetzung für Sicherheit schafft ausschließlich die Überwachung relevanter Matrices mithilfe der instrumentellen Analytik.

Gebot der Stunde

Die Analyse von Glyphosat und seines wichtigsten Metaboliten, der Aminomethylphosphonsäure (AMPA), erfolgt in der Regel mittels HPLC, gekoppelt an die multidimensionale massenselektive Detektion (MS/MS). Bei der Entwicklung unserer Methode haben wir uns an einer anreicherungsfreien LC-MS/MS-Spurenanalyse von Glyphosat und AMPA aus Wasser durch Direktinjektion [4] gemäß geltender Vorschrift orientiert. Der Fokus lag nicht darauf, die bestehende Methode zu kopieren, sondern auf deren Weiterentwicklung und Automatisierung, verbunden mit einer signifikanten Steigerung von Prozesseffizienz, Sensitivität und Messgenauigkeit auf Standardsystemen. Insbesondere wollten wir die Sensitivität durch einen Anreicherungsschritt erhöhen.

Die Schritte der HPLC-MS/MS-Methodenentwicklung

Die Verbindung Glyphosat sowie ihr wichtigster Metabolit, die Aminomethylphosphonsäure (AMPA), sind von ihrer Molekülstruktur her zunächst einmal nur bedingt flüssigchromatographierbar aufgrund ihrer hohen Polarität, wohl aber ihre Derivate, hergestellt gemäß DIN/ISO 214587 [5] in Reaktion mit 9-Fluorenylmethyl-chlorformiat (FMOC-Cl).

Die im vorliegenden Fall effiziente Automatisierung insbesondere der Derivatisierung von Glyphosat und AMPA mit FMOC-Cl ermöglicht eine präzise und sensitive Bestimmung sowie einen bemerkenswerten Probendurchsatz.

Diesen Schritt der Probenvorbereitung, sprich: die Zugabe und Dosierung von Standardlösungen und Derivatisierungsreagenz, führten wir mit dem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS) aus. Für die Probenaufreinigung und um eine höhere Sensitivität der Messung zu erreichen, wurde eine Festphasenextraktion (SolidPhaseExtraction, SPE) durchgeführt. Verwendet wurde dafür eine spezielle Extraktionseinheit (GERSTEL-SPExos), die zwischen Autosampler und HPLC-System, hier ein UHPLC-System 1290 der Marke Agilent Technologies, geschaltet wird. Im Gegensatz zu herkömmlichen SPE-Modulen arbeitet die SPExos-Extraktionseinheit mit kleineren Kartuschen. Die Sorbensmenge beträgt nur 50 mg; bei der konventionellen SPE hingegen kommen Sorbensvolumina von 100 bis 1000 mg zum Einsatz. Die Elution erfolgt mit einer signifikant geringeren Menge Lösemittel – und zwar online, das heißt, die Kartusche wird in den Strom der mobilen Phase  der HPLC-Analyse geschaltet und das Eluat direkt und quantitativ auf die Trennsäule überführt. Die Umschaltung zwischen Extraktion, Aufreinigung und Elution erfolgt vollständig automatisiert und lässt sich per Mausklick – wie der gesamte Prozess – komfortabel in die Probenvorbereitungsmethode eingeben. Die Probenvorbereitung lässt sich dergestalt steuern, dass die Aufgabe der nächsten Probe just in time exakt dann erfolgt, sobald die Messung der vorherigen Probe abgeschlossen ist (PrepAhead-Funktion).

Zur Detektion von Glyphosat und AMPA setzten wir ein Triple Quadrupol Massenspektrometer 6460 von Agilent Technologies ein. Die FMOC-Derivate von Glyphosat und AMPA wurden im negative Ion Mode (ESI) detektiert.

Schlussbetrachtung und Ausblick

Mit der von uns entwickelten MPS-SPExos-LC-MS/MS-Methode bestimmten wir erfolgreich Glyphosat und dessen wichtigsten Metaboliten, die Aminomethylphosphonsäure (AMPA), in unterschiedlich dotierten Wasserproben. Die Bestimmung einer Verdünnungsreihe ergab eine ausgezeichnete Linearität von 0,999 und eine sehr niedrige Bestimmungsgrenze von 10 ng/L (LoQ). Matrixeffekte wurden nach der Aufarbeitung in keiner der untersuchten Wasserproben beobachtet. Wiederfindung und Wiederholbarkeit ergaben exzellente Werte. Damit liegt uns eine hochsensitive, reproduzierbare und robuste Methode vor, die sich – wie unsere Erfahrung zeigte – für den selektiven und sensitiven Nachweis von Glyphosat und AMPA sowohl aus Wasser als auch aus Lebensmittel- und Umweltmatrices eignet. Unter anderem wurden von uns folgende Matrices auf Glyphosatrückstände untersucht: Tee, Leinsamen und Getreide.

Für uns als Anwender interessant erwies sich der Einsatz des oben beschriebenen MPS-SPExos-LC-MS/MS-Systems insbesondere dahingehend, dass wir eine Probenanreicherung, verbunden mit einer Probenaufreinigung und Online-Probenaufgabe, durchführen konnten. Nicht zuletzt ließen sich aufgrund der kleinen SPE-Kartuschen große Mengen Lösemittel einsparen, die unter herkömmlichen Bedingungen zum Einsatz gekommen wären. Ferner erwies es sich als hilfreich und nützlich, auf die Bandbreite der Möglichkeiten des MPS-Autosamplers, etwa Filtration, Zentrifugieren und Einengen, bei Bedarf zurückgreifen zu können. Sämtliche Schritte lassen sich in den Kontext der HPLC-Analyse einbinden und automatisiert durchführen. Fazit: Die Automatisierung einer in der Praxis bewährten manuellen SPE-Methode führt zu einer nachhaltigen Leistungssteigerung und Arbeitserleichterung für den Anwender. Nicht nur die Zahl manueller Arbeitsschritte lässt sich reduzieren, sondern ebenso die Menge an eingesetzter Probe. Der Einsatz des GERSTEL-MPS-SPExos-LC-MS/MS-System zum automatisierten Nachweis von Glyphosat und AMPA senkt den Bedarf an Lösemitteln nachhaltig. Nicht zuletzt führt die im Vorangegangenen vorgestellte Methode zu einer deutlichen Steigerung von Effizienz und Produktivität. Es bleibt zu prüfen, ob sich auch andere, auf herkömmliche Weise durchgeführte Analysenmethoden mit dem vorgestellten System effizient automatisieren lassen.

 

Literatur

[1] Marx C., Pastrana Pérez J.C., Hustedt M., Barcikowski S., Haferkamp H., Rath T. "Selektive Unkrautbekämpfung mittels Lasertechnik." Julius-Kühn-Archiv 434 (1) (2012), 215-222.
[2] Riley, P., Cotter, J., Contiero, M., Watts, M., "Herbicide tolerance and GM crops: Why the world should be Ready to Round Up glyphosate." Greenpeace International. GRL-TN 03/2011, June 2011. Amsterdam
[3] "Fragen und Antworten zur gesundheitlichen Bewertung von Glyphosat", FAQ des BfR vom 11. November 2011
[4] Uwe Böhland, Birgit Schwarz, "Anreicherungsfreie LC-MS/MS-Spurenanalyse von Glyphosat und AMPA aus Wasser durch Direktinjektion der FMOC-Derivate“, Posterpräsentation Langenauer Wasserforum 2010
[5] International Organization for Standardization (ISO) Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC2, Physical, chemical and biochemical methods: Determination of glyphosate and AMPA – Method by high performance liquid chromatography (HPLC) and fluorimetric detection