Probenvorbereitung

1,2 mL Urin wurden mit 120 µL NaOH versetzt, geschüttelt und 10 Minuten lang bei 6000 Umdrehungen pro Minute (UpM) zentrifugiert. Aus dem Überstand wurden 1,1 mL entnommen (das entspricht einer Menge von 1 mL Urin) und für die DPX eingesetzt. Die Abwicklung aller nachfolgenden Probenvorbereitungsschritte erfolgt vollständig automatisiert auf dem GERSTEL-MultiPurposeSampler (MPS) und zeitlich mit der GC/MS-Analyse verschachtelt. Gemäß Programmierung konditionierte der MPS das Sorbensmaterial mit 500 µL Methanol und spülte mit 2 mL Wasser nach. Anschließend wurde die Probe aufgezogen, insgesamt dreimal. Durch Aufziehen von Luft wurden Probe und Sorbensmaterial durchmischt. Jeweils im Anschluss daran wurde die überschüssige Probe aus der Pipette entleert und verworfen. Nach einer erneuten Spülung des Sorbensmaterials mit 2 mL Wasser erfolgte die Elution der Analyten mit 500 µL Aceton.

Aufziehen der Harnprobe in die mit dem Sorbensmaterial versehene Pipettenspitze.
Probe vor DPX mit WAX (gelbe Flüssigkeit) und nach der DPX (farblose Flüssigkeit)
Chromatogramm der mittels des GERSTEL-DPX-LVI-GC/QQQ-MS-Systems bestimmten Dopingmittel.
Die Detektion der Wirkstoffe erfolgte auf einem Agilent 7000 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, wobei stets drei MS/MS-Übergänge je Analyt aufgezeichnet wurden.
Die Messungen ergaben eine ordentliche Linearität über einen weiten Messbereich.
Danksagung

Die GERSTEL GmbH & Co KG dankt Dr. Chin Tong Tan und Dr. Shawn Stanley vom Singapore Turf Club für die hervorragende Zusammenarbeit bei der Methodenentwicklung sowie Herrn Dr. Ulrich Flenker von der Deutschen Sporthochschule Köln für die Bereitstellung der Proben.

Arzneimittel- und Drogenanalytik

Dopingsünder auf vier Hufen

Je nach Komplexität einer Matrix erweist sich die Probenvorbereitung, insbesondere die gewählte Extraktionstechnik, als Schlüssel zum Analysenerfolg. Für den Nachweis von Arzneimittelwirkstoffen beziehungsweise forensisch relevanter Verbindungen aus Körperflüssigkeiten bietet sich, wie das folgende Beispiel zeigt, die dispersive Festphasenextraktion (DPX) als interessante Alternative zu konventionellen Techniken an.

Wenn hierzulande über sportliche Höchstleistungen diskutiert wird, fällt früher oder später der Begriff „Doping“, werden die Namen von Größen aus Radsport oder Leichtathletik genannt, die disqualifiziert wurden, weil sie leistungssteigende Präparate eingenommen haben. Kaum einer der Diskutanten käme vermutlich auf die Idee, dass auch Tiere gedopt sein können. Anders in Asien, den USA oder im Nahen Osten, wo der Pferde- oder Kamelrennsport überaus beliebt und weitverbreitet ist. Nicht allein des Vergnügens wegen, sondern auch und vor allem deshalb, weil sich im Tierrennsport viel Geld verdienen lässt. Ein Reitstall, der seine Aussichten auf den Sieg optimieren und  aus einem lahmen Gaul ein schnelles Pferd machen will, findet abseits der konventionellen Trainingsmethoden probate Hilfsmittel im Chemiebaukasten. Allerdings: Wer die Leistung seines Tieres temporär unter Einsatz dubioser Präparate steigern will, begeht kein Kavaliersdelikt. Auch das Dopen von Pferden und Kamelen ist illegal, also verboten.
Eine institutionelle Speerspitze im Kampf gegen Dopingsünder im Tierrennsport ist die Association of Official Racing Chemists (AORC) [1], eine vergleichsweise kleine Vereinigung mit nur rund 100 Mitgliedern in 26 Ländern, die turnusmäßig Workshops abhält, um sich über neueste Entwicklungen in puncto Wirkstoffforschung und Methoden zum Nachweis von Dopingmitteln zu verständigen und auszutauschen. Im vergangenem Jahr trafen sich deren Experten für Dopinganalytik im „Turf Club“, einem der führenden Ausrichter von Pferderennen in Singapur [2].

Von den Experten viel beachtet, präsentierte GERSTEL dort – wir berichteten darüber kurz in der GERSTEL Aktuell 44 – ein vollständig automatisiertes, auf der sogenannten Disposable Pipette Extraction (DPX) [3] basierendes GC/MS-Verfahren unter anderem zur Bestimmung leistungssteigernder Substanzen wie Koffein und leistungsmindernder Präparate wie Diazepam in der Matrix „Pferdeurin“. Unter Einbeziehung der Workshopteilnehmer wurde die Praxistauglichkeit des Verfahrens vor Ort erfolgreich an dotierten Realproben getestet.

Pferdeharn – ein ganz besonderer Saft

Der Weg dorthin, sprich: bis das Verfahren stand, erwies sich als enorme Herausforderung, berichtet der GERSTEL-Applikationsspezialist Dr. Oliver Lerch: „Anders als Humanurin, der vergleichsweise sauber ist, enthält der Urin einiger Pflanzenfresser, im vorliegenden Fall Pferde- beziehungsweise Kamelharn, u. a. eine Vielzahl phenolischer Verbindungen, die den Nachweis von Arzneimittelwirkstoffen erschweren können“, erklärt der promovierte Chemiker. Bevor deren Bestimmung mittels Gaschromatographie und massenselektiver Detektion (GC/MS) gelingen konnte, bedurfte es zunächst einmal eines geeigneten Extraktionsverfahrens, mit dem sich störende Matrixbestandteile abtrennen beziehungsweise die Analyten wirksam anreichern ließen. Dieses Ziel vor Augen und den Wunsch des AORC im Hinterkopf, man möge ein schnelles, idealerweise leicht zu automatisierendes Verfahren entwickeln, rückte insbesondere die DPX rasch in den Fokus des Applikationsexperten.
Bei der DPX handelt es sich vereinfacht gesagt um eine Festphasenextraktionstechnik (Solid Phase Extraction, SPE), deren Festphase, anders als bei der klassischen SPE, nicht in Form einer gepackten Säule vorliegt, sondern innerhalb einer Pipettenspitze frei beweglich ist. Dadurch werde einerseits der Stoffaustausch mit der flüssigen Probe um ein Vielfaches beschleunigt, andererseits sei auch das benötigte Probenvolumen deutlich geringer, erklärt Dr. Oliver Lerch. Dieser Aspekt, verbunden mit der Möglichkeit, das Sorbensmaterial frei zu wählen und auch den Analysenablauf einschließlich Probenvorbereitung, Chromatographie und Detektion intelligent zu automatisieren, brachte die DPX auf die Poleposition des Applikationsexperten.

Matrixeffekte beeinflussen die Wahl des Sorbens

In Zusammenarbeit mit Kollegen des „Turf Clubs“ in Singapur experimentierte Dr. Oliver Lerch mit verschiedenen Sorbenstypen, wobei er sich letztlich für ein WAX-Material (Weak Anion Exchange, mixed mode) entschied. Ausschlaggebend für seine Wahl war folgende Überlegung: Die im Pferdeharn enthaltenen Phenole werden im alkalischen Milieu zum Teil deprotoniert und binden somit an Anionentauscher. Die ungeladenen Analyten wiederum binden an die „Back-bones“ des Sorbens und lassen sich mit organischem Lösemittel eluieren. Die gebundenen Phenole verbleiben auf dem Sorbens und werden auf diese Weise zu einem großen Teil abgetrennt.

Automatisierter Liner-Wechsel optimiert das Ergebnis

„Ungeachtet aller Maßnahmen zur Aufreinigung und Extraktion der fraglichen Analyten enthält die Pferdeharnprobe nach wie vor eine Menge belastender Matrixkomponenten, die sich negativ auf Analyse und Gerät auswirken können, insbesondere wenn zur Steigerung der Sensitivität eine LargeVolume-Injektion (8 µL) vorgenommen werden soll“, bilanziert Dr. Oliver Lerch. Aus diesem Grund sei es erforderlich, den Liner des PTV-Inlets (GERSTEL-KaltAufgabeSystem, KAS) des verwendeten Gaschromatographen (Agilent 7890 GC), in den die Probe injiziert wird, in gewissen Abständen auszutauschen, was – manuell durchgeführt – einen erheblichen Mehraufwand bedeutet. Der MPS verfügt jedoch über die Option „Automated Liner Exchange (ALEX)“, mit dem sich dieser Schritt komfortabel und effizient automatisieren lässt. „Damit sind lange GC-Sequenzen ohne Leistungseinbußen möglich; es bedarf keiner unmittelbaren Betreuung durch das Laborpersonal, was bedeutet, dass sich Proben in großer Zahl auch über Nacht und am Wochenende abarbeiten lassen“, erklärt der Applikationsexperte. Um Hochsieder effektiv entfernen zu können und die Stabilität der Säule sowie der Retentionszeiten dauerhaft zu gewährleisten, verwendete Dr. Lerch zwei Säulen (beide 15 m HP-5ms UI 0,25 mm, 0,25 µm) mit einem sogenannten Mid Column Backflush: „Auf diese Weise war es möglich“, berichtet Dr. Lerch, „belastende Matrixbestandteile nach einer definierten Zeit in Aufgaberichtung von der Säule zu spülen.“
Die Detektion erfolgte schließlich auf einem Agilent 7000 Triple Quadrupol-Massenspektrometer, wobei stets drei MS/MS-Übergänge je Analyt aufgezeichnet wurden.

Die einwandfreie Funktionsweise und Praxistauglichkeit des DPX-LVI-GC/QQQ-MS-Systems im Rahmen der Dopingkontrolle stellte der Wissenschaftler schließlich durch den Nachweis einer Reihe von Dopingmitteln unter Beweis, die häufig im Pferderennsport eingesetzt werden beziehungsweise bei Kontrollen entdeckt wurden [4]. Bei den Verbindungen handelte es sich namentlich um: Lidocain, Clenbuterol, Promazin, Diazepam, Testosteron, Boldenon und Prednisolon. Die Messung habe eine ordentliche Linearität über einen weiten Messbereich gezeigt, ergab Korrelationskoeffizienten zwischen 0,9971-0,9998, eine Wiederfindung von mehr als 90 % (für die meisten Verbindungen) und eine Standardabweichung (RSD) von unter 6 %. „Mit anderen Worten“, bringt Dr. Oliver Lerch die Reaktionen der Anwender auf dem Workshop der Association of Official Racing Chemists (AORC) in Singapur auf den Punkt, „überzeugten neben der komfortablen Automatisierung unserer Methode vor allem auch die erbrachten Leistungen.“

Analyt  Linearer Bereich [ng/mL]  Korrelations-koeffizient  Wiederfindungs-rate [%]  RSD[%] (n=8)  Mittlere Abweichung der Retentionszeit vom Mittelwert der Retentionszeiten [min]   
Koffein <0,1   >300  0,9982 98 4,5  0,007
Lidocain  <1    >100 0,9981 106 3,2 0,004
Clenbuterol  <1    >300 0,9998 90 5,4 0,005
Promazin  <0,1   >300 0,9979

51

7,7 0,003
Diazepam  <0,1   >100 0,9992 93 1,7 0,003
Testosteron  <2    >300 0,9997 85 4,2 0,003
Boldenon  <2     >100 0,9989 96 3,0 0,003
Prednisolon  <10   >300 0,9993 24 12,0 0,005

Messergebnisse der untersuchten Dopingmittel

 

Weiterführende Informationen

[1] www.aorc-online.org/home/
[2] www.turfclub.com.sg
[3] www.gerstel.de/de/automatisierte-dpx.htm
[4] www.horseracingintfed.com/2009DopingControl_Report.pdf