Charakteristisches Chromatogramm für eine niedrig konzentrierte QC-Probe.
Analysenbedingungen LC
 Mobile Phase: A – 5 mM Ammoniumformiat in Wasser mit 0,01 % Ameisensäure
B – 0,01 % Ameisensäure in Acetonitril
 Gradient: 0,0 min 94 % A / 6 % B
0,3 min 94 % A / 6 % B
14 min 5 % A / 95 % B
17 min 5 % A / 95 % B
 Druck 600 bar
 Flussrate: 500 µL/min
 Laufzeit: 17 min
 Equilibrierzeit: 2,5 min
 Säule: 2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm,Zorbax Eclipse Plus C18
RRHT (Agilent)
 Ofen: 55 °C
 Injektionsvolumen 2 µL 
Analysenbedingungen MS
 Betriebsmodus: Elektrospray, positiver Modus (jet stream)
 Zeitfilter: 0,04 min
 Scan-Typ: Dynamischer MRM
 Delta EMV: 0 V
 Zykluszeit: 660 ms
 Gastermperatur: 225 °C
 Gasfluss (N2): 10 L/min
 Zerstäuberdruck: 25 psi
 Hüllgas (N2): 350 °C / 11 L/min
 Kapillarspannung: 4500 V
 Düsenspannung:  500 V 
Charakteristisches Chromatogramm eines reinen Standards von 10 ppb.
Charakteristisches Chromatogramm eines Hopfenmatrix-basierten Standards von 10 ppb.
   
Charakteristisches Chromatogramm eines Ginsengmatrix-basierten Standards von 10 ppb.
Automatisierte Vorbereitung eines reinen Standards: Thiabendazol. Die Kalibriergeraden waren von mindestens 1 bis 200 ppb linear, wobei eine lineare 1/x-Regressionsmethode verwendet wurde.
Autoren
Fred Foster
GERSTEL, Inc., 701 Digital Dr. Suite J,
Linthicum, MD 21090, USA
Paul Roberts
Anatune, Ltd., Broadway House, 148-152 St.
Neots Road, Hardwick, Cambridge, CB23 7QJ, UK
Peter Stone
Agilent Technologies, 5301 Stevens Creek
Blvd., Santa Clara, CA 95051-7201, USA
Joan Stevens
Agilent Technologies, 2850 Centerville Rd.,
Wilmington, DE 19808, USA
Jon Wong, Kai Zhang
US FDA, 5100 Paint Branch Parkway, HFS-3
36, College Park, MD 20740, USA

Pestizide

Rückstandsanalytik vom Feinsten

Pestizidrückstände in Lebensmitteln lassen sich sicher und sensitiv bestimmen. Zur GC/MS- bzw. LC/MS-Analyse gelangen zunehmend QuEChERS-Extrakte, die aufgrund ihrer hohen Matrixlast jedoch aufzureinigen sind. Die konventionelle manuelle Vorgehensweise ist mit zahlreichen zeit- und arbeitsintensiven Schritten verbunden. Die Automatisierung der Aufreinigung erweist sich als sinnvoll und möglich.

Der chromatographische Nachweis von Pestizidrückständen in einer Reihe von Lebensmitteln [1], insbesondere in Obstund Gemüseproben, erfolgt zunehmend nach Extraktion der Analyten gemäß der QuEChERS-Methode. Sie empfiehlt sich sowohl dem Namen als auch der Laborpraxis nach als schnelle, einfache, preiswerte, effektive, robuste und sichere Art der Probenvorbereitung (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Allerdings sind die resultierenden Extrakte in der Regel immer noch stark matrixbehaftet, sodass sie vor der GC/MS- beziehungsweise LC/MS-Analyse mittels dispersiver SPE und Zentrifugieren aufzureinigen sind – manuell ein sehr zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Hierin liegt das wohl einzige Manko der revolutionären QuEChERS-Methode, das sich allerdings ausschalten lässt, wird die Aufbereitung des Extrakts automatisiert. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, eine dispersive Festphasenextraktion (dSPE) zur Reinigung der QuEChERS-Extrakte zu automatisieren, verbunden mit unmittelbar sich anschließender LC-MS/MS-Analyse [2] der gereinigten Extrakte.

GERSTEL-DualHead- MultiPurposeSampler
(MPS XL), konfiguriert für automatisierte Aufreinigung
und LC-MS/MS-Analyse von QuEChERS-Extrakten.

Material und Methoden

Instrumentierung: Die Automatisierung der Probenvorbereitung erfolgte auf einer GERSTEL-MPS-PrepStation (XL Dual-Head-MultiPurposeSampler), ausgestattet mit einer Zentrifuge. Getrennt wurden die Analyten auf einem Agilent 1290 HPLC, detektiert vermittels eines Agilent G6460A Triple-Quadrupol-Massenspektrometers. Sensitivität und Selektivität des LC-MS/ MS-Systems ermöglichen eine Realisierung der von Kontrollbehörden geforderten niedrigen Nachweisgrenzen. Die Injektion der Proben erfolgt via Probenschleife (2 μL). Materialien: Untersucht wurden von der US Food and Drug Administration (FDA) zur Verfügung gestellte und mit Pestiziden angereicherte Hopfen- und Ginsengproben.
Gleiches gilt für in Acetonitril angesetzte Stammlösungen unterschiedlicher Pestizide (siehe Tabelle auf Seite 22). Durch Verdünnung der Stammlösung mit mobiler Phase sowie reinem Hopfen- und Ginsengextrakt wurden Kalibrierungs- und Matrix-angepasste Standards mit Konzentrationen von: 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100; 200; 500 und 1000 ng/mL hergestellt.

Vorbehandlung des QuEChERS-Acetonitril-Extrakts: 1 mL Extrakt werden aus dem ersten Zentrifugationsschritt der QuEChERS-Methode in ein Vial pipettiert, das mit einem zur Aufreinigung fetthaltiger Proben geeigneten Sorptionsmaterial gefüllt ist. Anschließend wird das Gefäß an entsprechender Stelle in der GERSTEL-MPS- PrepStation positioniert. Die Schritte der nachfolgenden automatisierten QuEChERS-Aufreinigung sind im folgenden Schema dargestellt:

Probenvorbereitung
Automatisierte QuEChERS-Aufreinigung
Schütteln der jeweiligen Probe für 1 Minute.
Zentrifugieren bei 575 g für eine Dauer von 3 Minuten.
Filtrieren von 500 μL des resultierenden Überstands durch einen 0,45 μm Filter.
Mischen von 100 μL des resultierenden Filtrats mit 400 μL mobiler Phase A in einem sauberen 2-mL-Vial.
Schütteln des Probenvials (30 Sekunden).
Injektion von 2 μL in das LC-MS/MS-System.

Die Vorbereitung aller Standards erfolgte mit der für die automatisierte QuEChERS-LC-
MS/MS-Analyse konfigurierten GERSTEL-MPS-PrepStation:
Transfer von 100 μL vorher extrahierter reiner Matrix oder 100 % Acetonitril in ein leeres 2-mL-Autosampler-Vial.
Transfer von 250 μL der mobilen Phase A in das Vial.
Transfer von 150 μL der jeweiligen Stammlösung in das Vial.
Schütteln des Vials (30 Sekunden).
Schema: Prep-Sequenz für die Durchführung eines automatisierten QuEChERS-LC-MS/MS-Durchlaufs.
Screenshot des Probenvorbereitungsszenarios in der MAESTRO-Software.

Ergebnis und Diskussion

Die Erfassungsparameter des Massenspektrometers und die jeweiligen Quantifier/Qualifier-Ionenübergänge wurden mithilfe der Pestizid-Datenbank für die MassHunter-Software ausgewählt. Rund 200 Pestizide wurden mit der hier vorgestellten automatisierten MPS-PrepStation-LC-MS/MS-Methode untersucht (siehe Tabelle unten) und erfolgreich in pflanzlichen Extrakten (Hopfen und Ginseng) bestimmt. Die Gesamtzeit, die per Probe für die Reinigung des QuEChERS-Extrakts benötigt wurde, betrug 15 Minuten und damit weniger als die Dauer des LC-MS/MS-Analyselaufs. Probenvorbereitung und Analyse ließen sich zeitlich verschachteln; der Probendurchsatz wurde maximiert und die Produktivität des Verfahrens signifikant gesteigert.

 

Literatur

[1] Fully Automated QuEChERS clean-up and LC/MS-QQQ analysis of pesticides in Fruits and Vegetables. Anatune Chromatography Technical Note, No. AS90, Paul H. Roberts, Anatune Ltd., 2009.
[2] Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: collaborative study. Lehotay, SJ., J. AOAC Int. 90 (2007) 485

 

Übersicht der rund 200 Pestizide, die mit der automatisierten QuEChERS-LC-MS/MS-Methode bestimmt wurden.

3-Hydroxycarbofuran Acephat Acetamiprid Acibenzolar-S-methyl Alanycarb
Aldicarb Aldicarbsulfon Aldicarbsulfoxid Aspon Avermectin B1a
Avermectin B1b Azadirachtin Azoxystrobin Benalaxyl Bendiocarb
Benfuracarb Benoxacor Benthiavalicarb Benzoximat Bifenazat
Bifenthrin Bitertanol Boscalid Bromuconazol-1 Bromuconazole-2
Bupirimat Buprofezin Butafenacil Butocarboxym Butoxycarboxim
Cadusafos Carbaryl Carbendazim Carbetamid Carbofuran
Carboxin Carfentrazonethyl Chlordimeform Chlorfenvinphos-beta Chlorfluazuron
Chlorotoluron Chloroxuron Clethodim Clofentezin Clothianidin
Coumaphos Cumyluron Cyanazine Cyanophos Cyazofamid
Cycluron Cymoxanil Cyproconazol Cyprodinil Cyromazin
d10-Diazinon d6-Dichlorvos d6-Dimethoat d6-Diuron d6-Linuron
d6-Malathion Daimuron Dazomet Deltamethrin Diazinon
Dichlorvos Dicrotophos Diethofencarb Difenoconazol Diflubenzuron
Dimethenamid Dimethoat Dimethomorph A Dimethomorph B Dimoxystrobin
Diniconazol Dinotefuran Dioxacarb Disulfoton Dithiopyr
Diuron Dodemorph 1 Dodemorph 2 E-Fenpyroximat Emamectin B1a
Emamectin B1b Epoxiconazol Eprinomectin B1a EPTC Esprocarb
Ethidimuron Ethiofencarb Ethion Ethiprol Ethirimol
Ethofumesat Ethoprop Etobenzanid Etofenprox Etoxazol
Famoxadon Fenamidon Fenarimol Fenazaquin Fenbuconazol
Fenhexamid Fenoxanil Fenoxycarb Fenpropathrin Fenpropimorph
Fenuron Flonicamid Flucarbazone Fludioxinil Flufenacet
Flufenoxuron Flumetsulam Flumioxazin Fluometuron Fluquinconazol
Flusilazol Fluthiacetmethyl Flutolanil n Flutriafol Forchlorfenuro
Formetanat Fuberidazol Furalaxyl Furathiocarb Heptenophos
Hexaconazol Hexaflumuron Hexythiazox Hydramethylnon Imazalil
Imazapyr Imibenconazol Imidacloprid Indanofan Indoxacarb
Ipconazol Iprovalicarb Isocarbamid Isofenfos Isopropalin
Isoproturon Isoxaben Isoxaflutol Kresoximmethyl Lactofen
Leptophos Linuron Lufenuron Mandipropamid Mefenazet
Mepanipyrim Mepronil Metalaxyl Metconazol Methabenzthiazuron
Methamidophos Methiocarb Methomyl Methoprotryn Methoxifenozid
Metobromuron Metribuzin Mevinphos Mexacarbat Molinat
Monocrotophos Monolinuron Moxidectin Myclobutanil Neburon
Nitenpyram Norflurazon Novaluron Nuarimol Omethoat
Oxadixyl Oxamyl Paclobutrazol Penconazol Pencycuron
Phenmedipham Picoxystrobin Piperonylbutoxid Pirimicarb Prochloraz
Promecarb Prometon Prometryn Propachlor Propamocarb
Propargit Propazin Propham Propiconazol Propoxur
Pymetrozin Pyracarbolid Pyraclostrobin Pyridaben Pyrimethanil
Pyriproxyfen Quinoxyfen Rotenon Sebuthylazin Secbumeton
Siduron Simazin Simetryn Spinosyn A Spinosyn D
Spirodiclofen Spiromesifen Spiroxamin Sulfentrazon Tebuconazol
Tebufenozid Tebufenpyrad Tebuthiuron Teflubenzuron Temephos
Terbumeton Terbutryn Terbutylazin Tetraconazol Tetramethrin cis
Thiabendazol Thiacloprid Thiametoxam Thiazopyr Thidiazuron
Thiobencarb Thiofanox Thiophanatemethyl Triadimefon Triadimenol
Trichlamide Trichlorfon Tricyclazol Trifloxystrobin Triflumizol
Triflumuron Triticonazol Uniconazol Vamidothion Zoxamid