Versuchsaufbau
Die Analyse der Proben wurde an zwei GC/MS-Systemen (GC 6890/MSD 5973 von Agilent Technologies) durchgeführt. Für die Analyse der Twister-Proben wurde der GC 6890 mit einem GERSTEL-KaltAufgabeSystem (KAS) und einer GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU) ausgestattet.
Für die Analyse der Flüssig-flüssig-Extraktionen wurde der zweite GC/MS mit dem Agilent-Split/Splitless-Eingang und dem 7673 ALS ausgestattet. Die verwendete Säule, das Ofentemperaturprogramm, der Säulenfluss und die MS-Bedingungen waren dieselben wie für die TDU-Anwendung beschrieben.
Twister-Methode
Säule: 35 m Rtx-5Sil (Restek)
5 m Integraguard (Restek)
di = 0,20 mm, df = 0,33 μm
Pneumatik: Helium
Solvent-vent 50 mL/min
konst. Säulenfluss = 1,3 mL
Ofen: 70 °C (1 min); 25 °C/min;
310 °C (19,4 min)
MSD: Scan, 40-550 amu
TDU: Splitless,
30 °C; 60 °C/min; 270 °C
(5 min)
KAS: Split 20:1
-120 °C; 12 °C/s; 280 °C
(5 min)
Flüssiginjektion
S/SL: 250 °C, Splitless
Injektionsvolumen: 2 µL
Vergleich der Chromatogramme von der SBSE mit dem GERSTEL-Twister (A) mit der Flüssig-flüssig-Extraktion (B) vom Drogen und Medikamentenscreening einer Blutprobe (Fallstudie). Die Blutprobe war positiv für Propofol mit 0,5 mg/L und Diazepam mit 0,08 mg/L.
Screening von Medikamentenrückständen in Blut (A) und Urin (B) mit dem GERSTEL-Twister (SKF: interner Standard).

Arzneimittel- und Drogenscreening

Analytik mit Köpfchen

Die Analyse von Blut, Urin und Gewebe auf Arzneimittel- und Drogenrückstände zählt zu den Hauptaufgaben des forensisch-toxikologischen Labors. US-Anwender haben die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) erfolgreich für die effiziente Extraktion einer großen Bandbreite relevanter Analyten getestet. Auch die Mitglieder der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) konnten sich im Rahmen ihres Workshops „Post Mortem Toxikologie“ an der Universität Düsseldorf von der Wirksamkeit der SBSE mit dem GERSTEL-Twister in der forensisch-toxikologischen Praxis überzeugen [6,7].

Für die Arbeit des forensischen Toxikologen ist es bedeutsam, schnell Auskunft zu erhalten, ob eine von ihm untersuchte Urin-, Blut- oder Gewebeprobe, die in der Regel im Zusammenhang mit einer Ordnungswidrigkeit oder einem Kriminalfall genommen wurde, Drogen- oder Arzneimittelrückstände enthält. Durch ein Screening verschafft sich der Toxikologe einen Überblick über mögliche Analyten. Verläuft die Qualifizierung negativ, also ohne den Nachweis eines forensisch relevanten Inhaltsstoffs, ist der Fall für ihn abgeschlossen. Nicht so, verläuft das Screening positiv; dann folgt die Quantifizierung, die mengenmäßige Bestimmung der Analyten. Die Qualifizierung stellt somit den grundlegenden Schritt bei der Beurteilung des forensisch-toxikologischen und auch des juristischen Sachverhaltes dar. Wie die Praxis indes zeigt, reicht selten eine einzige Methode zur umfassenden Qualifizierung einer Körperflüssigkeit oder eines Körpergewebes; vielmehr kommt es auf eine kluge Kombination verschiedener Verfahren, Methoden und Techniken an, um den Sachverhalt hinreichend genau zu erhellen. Ungeachtet dessen liegt es im Interesse von Anwender, Polizei und Justiz, möglichst schnell und zeitoptimiert verlässliche und gerichtsverwertbare Resultate zu erhalten.

Attraktive Alternative zur Flüssig-flüssig-Extraktion

Optimierungspotenzial bietet vor allem die Probenvorbereitung, namentlich die Isolation und Anreicherung der Analyten, die im Bereich der forensischen Toxikologie häufig auf der Flüssig-flüssig-Extraktion, der Festphasen- Extraktion oder der Proteinabscheidung basiert. Mit dem Ziel, eine möglichst breite Palette forensisch relevanter Verbindungen in einem Schritt beziehungsweise mit einer Extraktionstechnik zu erfassen, haben Joseph A. Crifasi und Kollegen vom Saint Louis University Forensic Toxicology Laboratory in St. Louis, USA, die StirBarSorptiveExtraction (SBSE) mit dem GERSTEL-Twister auf den Prüfstand gestellt und sie mit der Flüssig-flüssig-Extraktion verglichen. Das Ergebnis ihrer Untersuchung lasse den Schluss zu, äußern sich die Wissenschaftler im Journal of Analytical Toxicology (30 [2006] 581-592), dass sich die SBSE als wirksame und attraktive Alternative gegenüber den in forensisch-toxikologischen Laboratorien gängigen Extraktionstechniken darstelle.
Der Einsatz des Twisters geschah im vorliegenden Fall mit dem Wissen, schreiben die Wissenschaftler, dass sich die SBSE bereits in einem breiten Anwendungsspektrum zur Extraktion und Analyse GC-gängiger organischer Analyten aus wässrigen Matrices bewährt habe, unter anderem beim Nachweis von Drogen- und Arzneimittelrückständen aus Urin, Wasser, Speichel und Rinderserum, Pestiziden in Wein, Verunreinigungen in Oberflächengewässern sowie Fremdund Konservierungsstoffen in Lebensmitteln. Um das Potenzial der SBSE für den Nachweis forensisch-toxikologischer Inhaltsstoffe aus biologischen Proben zu bestimmen, untersuchten Crifasi und Kollegen unter anderem Blutproben, die sie zuvor mit 145 verschiedenen Drogen- und Arzneimittelwirkstoffen versetzt hatten. Die anschließende Extraktion der Analyten erfolgte unter Routinebedingungen mittels der SBSE und – zum Vergleich – mittels der Flüssig-flüssig-Extraktion. Die Analyse wurde mit der GC/MS beziehungsweise der GC/NPD (Stickstoff- Phosphor-Detektion) vorgenommen. Am Rande bemerkt: Unter den eingesetzten Analyten befanden sich Wirkstoffe, die Bestandteil der Standard-Drogen- und Medikamentenmischung der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) sind, etwa Kokain, Kodein, Diazepam, Doxepin und Morphin. Als internen Standard setzten die US-Toxikologen Proadifen (SKF-525A) ein.

Kleiner Unterschied, große Wirkung

Das Handling macht den Unterschied: Die Flüssig-flüssig-Extraktion erfordert eine Vielzahl zeit- und arbeitsintensiver Schritte, bis die Probe in eine analysierbare Form überführt ist. Der pH-Wert muss mittels eines Carbonat-Bicarbonat-Puffers eingestellt werden, der interne Standard dosiert, die Probe gemischt, die Extraktionslösung erstellt und dosiert, die Probe extrahiert und zentrifugiert und der Überstand abgenommen, angesäuert und unter Stickstoff eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und in ein Autosampler-Vial überführt werden.
Der Aufwand für die SBSE erweist sich demgegenüber als ungleich geringer: Die jeweilige Probe wird in ein 20-mL-Headspace- Vial gegeben und mit 50 μL der Internen- Standard-Lösung versetzt. Anschließend gibt man den Twister in die Probe und füllt das Vial mit Pufferlösung auf. Die Vials werden verschlossen, auf einem Magnetrührer platziert und die Proben über Nacht auf höchster Stufe durchmischt. Tags darauf werden die Twister der Probe entnommen, mit destilliertem Wasser von anhaftenden Matrixbestandteilen befreit, trocken getupft und in ein TDU-Glasröhrchen überführt. Die automatisierte Desorption und GC-Analyse schließen sich an.

Innovative Extraktionsmethode für forensisch-toxikologische Laboratorien

Abgesehen vom Handling der Probenvorbereitung, das, auf den Punkt gebracht, kürzer und einfacher nicht sein kann, liefert die SBSE forensisch-toxikologisch relevanter Verbindungen aus komplexen und schwierigen Matrices wie Blut, Urin, Mageninhalt, Gallenflüssigkeit und Gewebe vergleichbar gute Resultate wie die alteingefahrene Flüssig-flüssig-Extraktion. Die Twister-Extraktionsmethode erweist sich laut den Wissenschaftlern als „brauchbare Alternative zu Flüssig-flüssig- oder Festphasenextraktionen für das Screening nach gängigen Drogen und Arzneistoffen in biologischen Proben“. Sie vereinfache die Extraktion im Vergleich zur typischen mehrstufigen Probenvorbereitung und mache den Einsatz von Lösungsmitteln, die normalerweise für Extraktionen gebraucht werden, überflüssig. Darüber hinaus erweise sich die SBSE aufgrund des relativ großen Phasenvolumens (24 μL) als sehr sensitiv, da sich die in der Sorbensphase des Twisters angereichterten Analyten zu 100 Prozent auf die GC-Säule transferieren lassen. Die Wiederfindungen eines Testgemisches aus 25 basischen Drogen liege je nach Verbindung zwischen 23 und 99 Prozent; durch Auswahl geeigneter Parameter für das Einlasssystem am Gaschromatographen (GERSTEL-KaltAufgabeSystem, KAS) und durch Konditionierung der wiederverwendbaren Twister-Rührstäbchen ließen sich Verschleppungen (Carry-over) verhindern.
Auf dem Weg aus der Versuchsphase in die Routineanalytik untersuchten die US-Wissenschaftler schließlich postmortal gewonnene Blutproben aus früheren Fällen und verglichen die Messergebnisse mit den Resultaten, die sie unter Einsatz der Flüssigflüssig- Extraktion ermittelt hatten. Ihr Fazit: „Twister-Extraktionen halten dem Vergleich mit den Flüssig-flüssig-Extraktionen, gefolgt von der GC/MS-Analyse, gut stand.“

 

Literatur

[1] Sandra, P., Baltussen, E., David, F.,Hoffmann, A., GERSTEL AppNote 1/2000.
[2] Vendenin, A., Suvorkin, V. und Kachur, E., GERSTEL AppNote 7/2004.
[3] Pfannkoch, E., Whitecavage, J., Bramlett, R., GERSTEL AppNote 6/2005.
[4] Crifasi, J., Bruder, M., Long, C. und Janssen, K. J. Anal. Tox. Ausgabe 30 (2006) 81-92.
[5] Crifasi, J., Bruder, M., Long, C. und Janssen, K. J., GERSTEL AppNote 11/2006.
[6] GERSTEL Aktuell 44 (2011) 11
[7] Lerch, O., Sperling, S., GERSTEL AppNote 8/2010.