Vitamin D3 (Cholecalciferol)
Roberts erstellte für die Vitamin-D-Analyten 25-OH-D2 und 25-OH-D3 je eine Vier-Punkt-Kalibrierung. Sie lieferte mit den Korrelationskoeffizienten 0,999 und 0,997 überaus zufriedenstellende Resultate.

Automatisierte Probenvorbereitung

Zugabe von 40 μL internem Standard (25-OH-Vitamin D-d6, 50 ng/mL) ins Probenvial.
Zugabe von 200 μL einer 0,2 M Zinksulfatlösung.
Zugabe von 500 μL Methanol zur Fällung der im Serum enthaltenen Proteine.
Transport des Vials zur Zentrifuge. Zentrifugieren der Probe für die Dauer von 1 min bei 3000 U/min zur Abtrennung der gefällten Proteine.
Konditionierung einer 50 mg C8-SPE-Kartusche mit 250 μL Methanol und nachfolgende Equilibierung mit 500 μL Wasser (HPLC-Grade).
Aufgabe von 500 μL Serumprobe (Überstand) auf die SPE-Kartusche.
Waschen der SPE-Kartusche mit 1 mL einer 60%igen Methanol-Lösung.
Trocknen der SPE-Kartusche.
Elution der Analyten mit zweimal je 100 μL Methanol in ein 300-μL-Vial.
Zugabe von 40 μL Wasser (HPLC-Grade) ins Probenvial.
Injektion von 20 μL Probe ins HPLC-System.

Methodenparameter

Parameter 25-OH-D2 25-OH-D3 25-OH-D3-d6
Precursor Ion 413,3 401,3 407,3
Product Ion (Q) 395,3 383,3 389,3
Product Ion (q) 159,1 159,1 159,1
Dwell 50 50 50
Fragmentor (V) 120 120 120
Collision Energy (Q) 5 5 5
Collision Energy (q) 25 25 25
MS-Einstellungen  
Gastemperatur: 200 °C
Gasfluss: 5 L/min
Kapillare: 2500 V 
Corona Current: 6 µA
Vaporizer Temp.: 170 °C
Nebulizer: 40 psi
Ladungsspannung: 2000 V
Zum Einsatz kam ein Agilent 6410B-Tandem-Massenspektrometer mit Multi Mode Source (MMS), betrieben im positiven simultanen ESI/APCI-Modus

Vitaminanalytik

Winterblues ade!

Vitamin D gehört zu den essenziellen Bestandteilen, die der Mensch zum Leben braucht. Um Mangelerscheinungen auszuschließen, ist der Vitamin-D-Spiegel im Serum zu bestimmen. Die zur klinischen Praxis zählende Analyse kann sich, je nach eingesetzter Messmethode, als überaus arbeits- und zeitintensiv erweisen. Zum Mittel der Wahl avancierte die HPLC, gekoppelt an die Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS), insbesondere auch, weil sich die Probenvorbereitung komfortabel und sicher automatisieren lässt.

Vitamin D (Cholecalciferol) ist ein für den menschlichen Organismus lebenswichtiger Baustein. Er nimmt eine Schlüsselrolle für Wohlbefinden und Gesundheit ein. Fehlt es an Vitamin D, steigt das Risiko zu erkranken. Eine klassische Mangelerscheinung ist die Rachitis, die mit einer mangelhaften oder fehlenden Verknöcherung der Knorpelmatrix des Knochens einhergeht. Zu der Risikogruppe gehören Neugeborene und Kleinkinder; in Deutschland erhalten die meisten Säuglinge in ihrem ersten Lebensjahr und eventuell
noch im zweiten täglich eine Rachitis-Prophylaxe.
Bei Schwangeren und älteren Menschen zeigt sich ein Mangel an Vitamin D ebenfalls meist an Veränderungen der Skelettstruktur: Die Knochen verformen sich (Osteomalazie) oder verlieren an Substanz, werden porös und brüchig (Osteoporose). Zurückführen lässt sich dieser wie jener Krankheitsverlauf auf eine wichtige Funktion, die das Vitamin D im Organismus erfüllt beziehungsweise, bei unzureichender Versorgung, nicht erfüllen kann: Es beeinflusst den Knochenstoffwechsel und die Aufnahme strukturstärkenden Kalziums ins Knochengewebe.

Zu den wichtigen Vitamin-D-Lieferanten zählen Lebensmittel wie Lebertran, Milchprodukte, Eier und fetthaltige Fische. Jedoch deckt der Mensch seinen Vitamin-D-Bedarf hauptsächlich über die Haut, in der es zu rund 90 Prozent photochemisch, induziert durch natürliches Sonnenlicht (UV-B), aus 7-Dehydrocholesterin gebildet wird, das wiederum ein Stoffwechselprodukt des körpereigenen Cholesterins ist. Bei zu geringer Sonnenexposition steigt folgerichtig das Risiko einer Vitamin-D-Unterversorgung. Hierzu kommt
es insbesondere in der dunklen und kalten Jahreszeit, aber auch in sonnenreichen Jahreszeiten und Gefilden, wenn die Haut im Übermaß durch Präparate und Bekleidung vor Sonneneinstrahlung geschützt wird.

Am Rande bemerkt: Inzwischen mehren sich die Belege, dass der Winterblues, eine hierzulande in Herbst und Winter geradezu kollektiv auftretende depressive Verstimmung, die sich spontan ins Gegenteil verkehrt, wenn mit Beginn des Frühjahrs die Sonnenscheindauer zunimmt, ebenfalls mit einer Unterversorgung des Organismus mit Vitamin D zusammenhängt. Naturvölker, heißt es, die sich vornehmlich an frischer Luft und in freier Natur bewegen, kennen keinen Vitamin-D-Mangel. Vitamin-D-Mangel lässt sich somit durchaus als Zivilisationskrankheit auffassen.

Sonnenlicht versus Nahrungsergänzungsmittel

Wenn weder die Gelegenheit zur Bewegung an frischer Luft besteht noch die Lust, die Vitamin-D-Speicher der Haut im Solarium aufzutanken, sucht mancher sein Heil in der Einnahme spezieller Präparate und Nahrungsergänzungsmittel, die Vitamin D enthalten. Um die Qualität eines solchen Präparats zu bewerten, ist der Blick auf die Liste der Inhaltsstoffe zu lenken. Vitamin D ist nämlich nicht gleich Vitamin D! Im ärztlichen Sprachgebrauch wird Vitamin D als Synonym für Vitamin D3 (Cholecalciferol) verwendet, wie es bekanntermaßen von Wirbeltieren produziert wird. In Pflanzen und Pilzen entsteht ebenfalls unter Einfluss von Sonnenlicht ein dem Cholecalciferol vergleichbarer Stoff, das Ergocalciferol, welches als Vitamin D2 bezeichnet wird. In einigen Ländern dient Vitamin D2 als wichtigste Ingredienz von Vitamin-D-Präparaten und -Nahrungsergänzungsmitteln.

Um sich ein differenziertes, aussagekräftiges Bild vom Vitamin-D-Spiegel eines Patienten zu machen, wird in der Regel die Konzentration des 25-Hydroxycholecalciferol
(25-OH-D3) im Serum bestimmt. Dabei handelt es sich, vereinfacht gesagt, um die Speicherform des Vitamin D, die im Verlauf des Leberstoffwechsels entsteht; die mittel- bis längerfristige Vitamin-D-Versorgung eines Organismus lässt sich mit diesem Parameter am besten beschreiben. Am Rande bemerkt: Liegt der Verdacht einer Stoffwechselstörung vor, erweist es sich als sinnvoll, die Konzentration des in der Niere verstoffwechselten, biologisch aktiven 1,25-(OH)2-Vitamin-D3 (Calcitriol) zu bestimmen. Die Bestimmung der Gesamtmenge des im Blut befindlichen Vitamin D ist dafür ungeeignet, da Calcitriol nur bedarfsabhängig synthetisiert wird.

Herausforderung: Vitamin-D-Spiegel-Bestimmung

Einen vollständigen Überblick über die im Blut zirkulierenden Mengen an Vitamin D liefert jedoch, und zwar aufgrund der Aufnahme Vitamin-D2-haltiger Lebensmittel, -Präparate und -Nahrungsergänzungsmittel, die Analyse beider 25-OH-Derivate. „Für die Quantifizierung von 25-OH-D3 und 25-OH-D2 hat sich die Hochleistungsflüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektroskopie (HPLC-MS/MS) als Mittel der Wahl erwiesen“, sagt Paul H. Roberts von der Anatune Ltd. in England.
Mit Unterstützung des University Hospitals of Leicester hat Roberts eine LC-MS/MS-Methode auf Basis der automatisierten Festphasenextraktion (SPE) entwickelt, mit der sich beide Stoffe sicher und effizient in Serumproben in einem Lauf bestimmen lassen. „Wesentlich für den Erfolg der Methode ist der Einsatz eines flexiblen Autosamplers sowie einer Steuersoftware, die es ermöglicht, den Vorgaben der Laboratorien an die Automatisierung der Analyse, einschließlich hohem Probendurchsatz und Kostenminimierung, Rechnung zu tragen“, weiß Roberts. Anatune Ltd. gehört in Großbritannien zu den führenden Anbietern automatisierter Komplettlösungen für die LC/MS und GC/MS. Resultat von Roberts’ Bemühungen war sozusagen eine „Ein-Knopfdruck-Messmethode zur quantitativen Bestimmung von 25-OH-D3 und 25-OH-D2“.

Technische Ausstattung

Um den Vorgaben effizienter Routineanalytik zu entsprechen, setzte Roberts die sogenannte Dualrail-Variante des GERSTEL-MultiPurposeSamplers (MPS, MPS-PrepStation) ein, der zwei unabhängig voneinander in alle Raumrichtungen agierenden Robotertürme zur automatisierten Probenvorbereitung und Probenaufgabe besitzt. Während der eine Turm mit einer vergleichsweise großvolumigen Flüssigspritze für die Durchführung der SPE ausgestattet ist, trägt der andere Turm eine Mikroliterspritze für die Injektion geeigneter kleiner Probenvolumina in das HPLC-System. Darüber hinaus verfügt die MPS-PrepStation im vorliegenden Fall über die Einbindung einer Zentrifuge. Getrennt und detektiert wurden die Proben auf einem „Agilent 1200 Serie HPLC“, verbunden mit dem „Agilent 6410 Triple Quadrupol Mass Spectrometer with HotBox and Multimode Source“.

Messmethode

Zur Kalibrierung des Systems verwendete Roberts eine kommerziell erhältliche 25-OH-D2/D3-Lösung, von der er eine Verdünnungsreihe erstellte. 200 μL Serum wurden in 2-mL-Standardvials gegeben, verschlossen und manuell auf ihre Position auf dem Probenteller der MPS-PrepStation gesetzt. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten voll automatisiert unter der Regie der zuvor von Roberts per Mausklick in der GERSTEL-MAESTRO-Steuersoftware erstellten Methode. (Wie sich die Probenvorbereitung mit der MPS-PrepStation gestaltet, zeigt das Ablaufschema rechts.) Die Trennung wurde auf einer Agilent-Trennsäule, Eclipse C18 2,1 x 50 mm mit 3,5 μm Partikelgröße, vorgenommen. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Wasser (Eluent A) und 0,1 % Essigsäure in Methanol (Eluent B). Eine Gradientenelution erfolgte von 20 % B innerhalb von zwei Minuten auf 90 % B (30 Sekunden). Die Säule wurde anschließend wieder auf Startbedingungen equilibriert. Der Säulenfluss betrug konstant 0,5 mL/min bei einer Säulentemperatur von 50 °C. Die Detektion erfolgte im ESI/APCI-Modus. Die Analyse einer Probe dauerte 5,5 Minuten, wobei sich die Effizienz durch Verschachtelung von Probenvorbereitung und -analyse maximieren ließ. Paul Roberts: „Die Korrelationskoeffizienten der Kalibriergeraden von 25-OH-D2 und 25-OH-D3 lagen bei 0,999 beziehungsweise 0,997. Die Validierung der Methode erfolgte durch die UTAK Laboratories Inc. mittels der Analyse von Vitamin-D3-Serum-Kontrollproben.
Die mit der MPSPrepStation erstellten Extrakte waren frei von störenden Matrixbestandteilen, sodass wir Chromatogramme erhielten, in denen die Zielanalyten 25-OH-D2und 25-OH-D3 sauber und deutlich zu erkennen und auszuwerten waren.“