Detaillierte Informationen

Pete Stevens
LECO Corporation
Saint Joseph, Michigan,
USA

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Überlagerung der mit der eindimensionalen GC aufgezeichneten Signale der infrage kommenden Metaboliten der Asparagusinsäure im Urin vor dem Spargelverzehr (blau) und danach (rot): Aceton (A), Essigsäureethylester (B), 4-Heptanon (C), 5-Methyl-2-(1-methylethyl)-cyclohexanon (D) und 1-(1,5-Dimethyl-4-hexenyl)-4-methylbenzol.

Metabolit-Profiling

Spargelzeit

Bereits wenige Minuten nach dem Verzehr wird der Konsument auf olfaktorische Weise daran erinnert, dass er Spargel gegessen hat. Applikationsexperten von LECO sind den Ursachen des spargeltypischen Uringeruchs nachgegangen: mittels GERSTEL-Twister (SBSE), ein- und zweidimensionaler Gaschromatographie (GCxGC) sowie unter Einsatz eines Flugzeitmassenspektrometers (Time-Of-Flight Mass Spectrometer, TOFMS).

Es dauert nur zehn bis 15 Minuten, bis der Verzehr ruchbar wird. Auch der Nachbar am Urinal merkt sofort mit seiner Nase: Die Spargelsaison hat begonnen. Nach einigem Rätselraten sind sich Wissenschaftler heute über den für Spargel typischen Uringeruch einig. Er lässt sich, wie Experimente zeigen, auf die im Spargel enthaltene Asparagusinsäure zurückführen, die im Organismus zu geruchsintensiven Schwefelverbindungen verstoffwechselt wird: zunächst zu S-Methylthioester, dann weiter zu Methanthiol, Dimethylsulfid, Dimethyldisulfid, Dimethylsulfon und schließlich zu Dimethylsulfoxid. Bei Testpersonen, die zwar keinen Spargel, dafür aber Asparagusinsäuren zu sich nahmen, stellte sich innerhalb kürzester Zeit genau der für Spargel typische Uringeruch ein.
Zur Aufklärung des Sachverhalts bedurfte es einer Analyse des Stoffwechsels und der resultierenden Metaboliten: „Traditionell werden die Proben (hier Urin) für die Dauer von rund 48 Stunden unter Einfluss von Wärme flüssig extrahiert, woraufhin man die Extrakte gasoder flüssigchromatographisch (GC/LC) auftrennt und die Analyten massenselektiv (MS) bestimmt“, schreibt Pete Stevens von LECO. Während sich die GC/MS beziehungsweise LC/MS vergleichsweise unkompliziert gestaltet, handelt es sich bei der Flüssigextraktion um ein sehr aufwändiges Prozedere, das obendrein häufig den Einsatz potenziell gesundheitsund umweltschädlicher Lösemittel erfordert. „Unser Ziel war es“, beschreibt der Applikationsexperte, „den Einsatz giftiger Lösemittel sowie die Extraktionsdauer nachhaltig zu reduzieren. Beides gelang uns mit der Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE).“

Technische Details: Durchgeführt wird die SBSE mit dem patentierten GERSTEL-Twister, einem mit Polydimethylsiloxan (PDMS) als Sorptionsmedium ummantelten Rührstäbchen für Magnetrührer, das die Stoffwechselprodukte extrahiert, während es die Probe durchmischt. SBSE und thermische Extraktion der Twister erfolgten automatisiert unter Einsatz des GERSTEL- MultiPurposeSamplers (MPS) und der GERSTEL-ThermalDesorptionUnit (TDU). Trennung und Analyse erfolgten mit einem LECO Pegasus 4D GCxGC-TOFMS-System. Für die ein- bzw. zweidimensionale GC (1D/2D) wird ein GC 6890 von Agilent Technologies zusätzlich mit einem Low-Thermal- Mass-Modul (LTM) ausgestattet, einem Säulenofen, der schnelle Heiz- und Kühlraten ermöglicht.
Die eindimensionale Trennung wird auf einer unpolaren Säule (10,0 m x 0,18 mm ID x 0,20 μm df Rtx-5) vorgenommen, die sich im LTM befindet und durch den GC-Ofen mit dem Injektor verbunden ist. Die Säule für die zweidimensionale Trennung, im GC-Ofen untergebracht, ist sehr kurz und von mittlerer Polarität (1,00 m x 0,10 mm ID X 0,10 μm df DB-17 ms). Zwischen beiden Säulen befindet sich ein LECO Dual-jet Thermal Modulator, der dazu dient, kontinuierlich das Eluat der ersten Säule zu trappen und in definierten Portionen auf die zweite Säule zu geben. Die zweidimensionale Trennung ermöglicht eine bessere Peak-Kapazität sowie eine höhere Auflösung der Signale. Breit eluierende Peaks der ersten Dimension werden im Modulator fokussiert und als scharfe Banden in der zweiten Dimension getrennt; die Peaks sind somit von schärferer Qualität und verfügen über ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis. Die Detektion erfolgte mit einem LECO Pegasus IV Time-of-Flight Mass Spectrometer (TOFMS), das für die GCxGC-Chromatgraphie sehr gut geeignet ist: „Für die schnelle Trennung auf der zweiten Säule wird ein Detektor benötigt, der sich durch eine schnelle Datenaufnahme auszeichnet“, sagt Dr. Eike Kleine-Benne von GERSTEL. Mit 500 Spektren pro Sekunde sei das Pegasus IV TOFMS bestens geeignet für die vorliegende Anwendung. Hinzu komme das TOF-Prinzip, das darauf basiert, für jedes Spektrum alle Ionen in der Ionenquelle simultan zu nutzen. Somit entspricht jeder Scan dem im jeweiligen Moment vermessenen Säuleneluat. „Diese Eigenschaften, gepaart mit einer hohen Spektrenrate, und die simultane Erfassung der Ionen erlauben zudem eine mathematische Trennung co-eluierender Substanzen, Stichwort: Deconvolution, da sich schon geringste Unterschiede der Retentionszeiten in den MS-Spektren widerspiegeln“, bemerkt Dr. Kleine- Benne. Für die eindimensionale Analyse wurde der Modulator ausgeschaltet und die GC-Ofentemperatur isotherm mit konstant 280 °C gefahren.

Probenvorbereitung: Um den Stoffwechsel der Asparagusinsäure untersuchen zu können, bat man Testpersonen um die Abgabe von Urinproben: jeweils 250 mL vor und etwa 90 bis 120 min nach dem Spargelverzehr. Die Proben wurden unverzüglich in 250-mL-Glasflaschen überführt, die jeweils ein Twister-Rührstäbchen (10 mm x 0,5 mm) enthielten. Die Extraktion der Analyten erfolgte, während der Twister die Probe mit 800 Umdrehungen pro Minute (UpM) durchmischte; eine Derivatisierung der Analyten erfolgte nicht, wie Pete Stevens schreibt. Die Handhabung des Twisters ist denkbar einfach: Nach Abschluss der Extraktion werden die Rührstäbchen mit einer Pinzette der Probe entnommen, mit destilliertem Wasser abgespült, mit einem Tuch trockengetupft und in ein TDU-Röhrchen für die anschließende automatisierte thermische Desorption überführt. Die ausgeheizten Analyten werden im KaltAufgabeSystem (KAS) cryofokussiert, um sie anschließend temperaturprogrammiert punktförmig und diskriminierungsfrei auf die Trennsäule zu überführen. Im vorliegenden Fall wurde die TDU im Splitless-Modus betrieben. Die Starttemperatur betrug 30 °C und wurde für die Dauer von 120 Sekunden gehalten. Anschließend ging es mit 700 °C/min auf eine Endtemperatur von 280 °C, die ihrerseits für die Dauer von zwei Minuten gehalten wurde. Die Cryofokussierung der Analyten im KAS erfolgte bei -120 °C; von dort ging es mit 12 °C/min auf 280 °C, diese Temperatur wurde für zwei Minuten gehalten.

Die Resultate der Messung bestätigten alle Vermutung: „Während sich in den Urinproben, die vor dem Spargelkonsum genommen wurden (Prä-Spargelurinproben), keinerlei verdächtige schwefelhaltige Metaboliten der Asparagusinsäure befanden, enthielten die Post-Spargelurinproben jede Menge davon“, bringt es Pete Stevens auf den Punkt (s. Abbildung). Deutliche Signale lieferten: Aceton (A), Essigsäureethylester (B), 4-Heptanon (C), 5-Methyl-2-(1-methylethyl)- cyclohexanon (D) und 1-(1,5-Dimethyl- 4-hexenyl)-4-methylbenzol. Ferner fanden sich auch Spuren von S-Methylpropenthioat und 1,4-bis-(Methylthion)- butan, nicht aber im Prä-Spargelurin. Ein ähnliches Bild lieferte die GCxGC-TOFMS- Analyse. Die Retentionszeit für S-Methyl-2-propenthioat lag in der ersten Dimension bei 205 Sekunden, in der zweiten Dimension bei 1,7 Sekunden.


 

Zweidimensionale Aufzeichnung der Messung der Urinproben vor und nach dem Spargelkonsum. Die relevanten Komponenten finden sich nicht in der Prä-Urinprobe (A), wohl aber in der Probe, die nach dem Verzehr von Asparagus genommen wurde (B).

 

Pete Stevens: „Mit unserem SBSE-MPS-GCxGC-TOFMS-System konnten wir die Bestimmung von Stoffwechselprodukten in Urin deutlich verbessern: Die Gesamtanalysenzeit wurde verkürzt, die herkömmlicherweise aufwändige und komplexe Probenaufbereitung effizient vereinfacht, erleichtert und verkürzt.“ Dank der Automatisierung der im Gesamtsystem integrierten GERSTEL- Module, MPS, TDS und KAS, ließ sich die manuelle Arbeit zugunsten einer höheren Effizienz und Reproduzierbarkeit der Messergebnisse auf ein absolutes Minimum reduzieren. Das GCxGC-TOFMS wiederum erbrachte eine bessere Auflösung der Messsignale und eine gute Trennung der co-eluierenden Peaks. Die verbleibende Co-Elution wiederum ließ sich mittels „True Signal Deconvolution“ auflösen – dank der hohen Geschwindigkeit, mit der das LECOPegasus- TOFMS Gesamtspektren aufzeichnet.