Autoren

Fredrick D. Foster, John R. Stuff, Edward A. Pfannkoch;
GERSTEL, Inc.,
701 Digital Dr. Suite J,
Linthicum, MD 21090,
USA.

Sparkle T. Ellison, William E. Brewer, Stephen L. Morgan;
Department of Chemistry and Biochemistry,
University of South Carolina,
631 Sumter Street,
Columbia, SC 29208,
USA.

Tom Gluodenis;
Agilent Technologies,
2850 Centerville Rd.,
Wilmington, DE 19808,
USA.

Für weitere Informationen kontaktieren Sie uns bitte per e-mail: gerstel@gerstel.com

Vorbehandlung der Urinproben Vorbehandlung der Vollblutproben
  • 260 μL Urin in ein sauberes Reagenzglas
    (12 x 75 mm) pipettieren.
  • 250 μL einer 1,0 M HCl in das Röhrchen
    pipettieren und für einige Sekunden
    vortexen.
  • 250 μL Acetonitril in das Reagenzglas pipettieren und für einige Sekunden vortexen.
  • Probe mit einem 2-in-1-Spritzenfilter von Agilent filtern und das Filtrat in einem sauberen Reagenzglas (12 x 75 mm) sammeln.
  • Gefilterte Urinprobe auf dem GERSTEL-
    MultiPurposeSampler (MPS XL) mit DPX-Option platzieren.
  • 200 μL Vollblut in ein sauberes Reagenzglas
    (12 x 75 mm) pipettieren.
  • 800 µL Acetonitril in das Röhrchen
    geben und für einige Sekunden vortexen.
  • Für zehn Minuten zentrifugieren und
    den Überstand in ein sauberes Röhrchen
    (12 x 75 mm) überführen.
  • Die Probe auf dem GERSTEL-Multi-
    PurposeSampler (MPS XL) mit DPX-Option platzieren.

Analysenbedingungen HPLC

 Säule: Zorbax Eclipse XDB C18 RRHT
(2,1 mm x 50 mm, 1,8 µm)
 Eluenten: A – 20 mM Ammonium-formiat, pH 8.6
B - 10% Isopropanol in Methanol
 Gradient:  
 Zeit (min) Fluss (mL/min)  Druck (bar)  %B 
 0 0,2  600 45
 2 0,2 600 45
 5 0,2 600 95
 9 0,2 600 95
 9,5 0,2 600 45
 Säulen-Temperatur: 35°C
 Injektionsvolumen: 2,5 µL
 Laufzeit: 10 min 

Analysenbedingungen MS

 Ionisierung:  ESI positive Ion Mode
 Gas-Temperatur:  350 °C
 Gas-Fluss (N2):  12 L/min
 Nebulizer pressure:  35 psi
 Capillary:  4,5 kV
Analysenbedingungen
 Analyten Precursor-Ion [m/z] Produkt-Ion(en) [m/z] Fragmentor Spannung [V] CE (V)
 Bromazepam 316 182,1 (209) 140 (140) 30 (25)
 Nitrazepam 282 236 (180) 160 (160) 25 (35)
 d4-Clonazepam 320 274,1 120 30
 Flunitrazepam 314 239 (268) 160 (160) 35 (30)
 clonazepam 316 270 (214) 120 (120) 25 (30)
 d5-α-OH-Alprazolam 330 302 120 30
 d5-Estazolam 300 272 140 25
 α-OH-Alprazolam 325 216 (297) 120 (120) 35 (30)
 Estazolam 295 205 (267) 160 (160) 40 (25)
 Clobazam 301 224 (259) 140 (140) 30 (15)
 Triazolam 343 239 (308) 180 (180) 40 (25)
 Alprazolam 309 274 (281) 160 (160) 30 (25)
 d5-Oxazepam 292 246 120 20
 Oxazepam 287 241 (269) 120 (120) 20 (15)
 Lorazepam 321 229 (275) 140 (140) 30 (20)
 Temazepam 301 255 (177) 120 (120) 35 (40)
 d5-Nordiazepam 276 213 160 30
 Nordiazepam 271 140 (165) 160 (160) 30 (30)
 Midazolam 326 249 (291) 180 (180) 40 (25)
 Diazepam 285 222 (257) 160 (160) 25 (25)
 Flurazepam 388,1 288 (315) 140 (140) 25 (20)
Parameter der MS/MS-Detektion
   
 Komponente  R² LOQ [ng/mL]
 TemazepamC 0,9917 0,5
 AlprazolamC 0,9901 0,5
 OxazepamC 0,9950 0,5
 LorazepamC 0,9908 0,5
 EstazolamD 0,9955 0,5
 α-OH-AlprazolamA 0,9958 0,5
 FlurazepamB 0,9937 0,5
 MidazolamB 0,9919 0,5
 FlunitrazepamE 0,9959 0,5
 DiazepamB 0,9969 0,5
 ClonazepamE 0,9974 0,5
 ClobazamC 0,9947 0,5
 BromazepamE 0,9973 0,5
 TriazolamC 0,9783 0,5
 NordiazepamB 0,9941 0,5
 NitrazepamC 0,9910 0,5
Repräsentative Kalibrationsgeraden von Triazolam und Clonazepam.
Ergebnis der Kalibrierung; verwendete interne Standards: d5-α-Hydroxyalprazolam (A), d5-Nordiazepam (B), d5-Oxazepam (C), d5-Estazolam (D) und d4-Clonazepam (E).
  Komponente Wiederfindung [%]
  Alprazolam 65
  a-OH-alprazolam 100
  Clonazepam 91
  Diazepam 80
  Flunitrazepam 86
  Lorazepam 49
  Nitrazepam 93
  Nordiazepam 91
  Oxazepam 91
  Temazepam 84
  Estazolam 90
  Clobazam 6
  Triazolam 54
  Flurazepam 82
  Midazolam 57
  Bromazepam 43
Wiederfindung der untersuchten 16 Benzodiazepine mit der DPX-LC-MC/MS-Methode: Die geringe Wiederfindungsrate von Clobazam basiert auf einer niedrigen Extraktionseffizienz. Im Gegensatz zu den anderen Benzodiazepinen enthält Clobazam keine protonierbaren Stickstoffzentren in der chemischen Struktur und bindet daher eher schlecht an das DPX-CX-Material. Dieses Ergebnis bestätigt die Spezifität des DPX-CX-Sorptionsmittels.

Automatisierte Probenvorbereitung

Auf Droge?

Umfassende Harnanalyse auf Drogenkonsum und Medikamentenmissbrauch mittels automatisierter dispersiver Festphasenextraktion (Disposable Pipette Extraction, DPX) und HPLC-MS/MS mit „Dynamic Multiple Reaction Monitoring“ (MRM).

Um biologische Proben auf Rückstände von Drogen und Medikamenten wie Benzodiazepinen zu untersuchen, ist es notwendig, die Probe so vorzubereiten, dass weder Matrixeffekte noch Ionensuppression auftreten können. Die Festphasenextraktion (SPE) ist im Allgemeinen die bevorzugte Technik zur Matrixabtrennung; in der hier beschriebenen Untersuchung wurde zur Extraktion die automatisierte, so genannte Disposable Pipette Extraction (DPX) verwendet. DPX ist eine schnelle dispersive Festphasenextraktionstechnik unter Verwendung lose in einer Einwegpipettenspitze liegender Sorbentien. Die Probe wird in die Spitze gesaugt und aktiv mit dem Sorbens vermischt. Die Vorteile der DPX-Technologie bestehen hauptsächlich darin, dass die Extraktion sehr schnell vonstattengeht, wenig Lösungsmittel verbraucht wird und der gesamte Prozess voll automatisiert werden kann, einschließlich der Probenaufgabe ins chromatographische System. Der MPS-Autosampler von GERSTEL erledigt DPX-Extraktionen in etwa fünf Minuten unter Einsatz verschiedenartiger Sorbentien: Reversed Phase (DPX-RP), Kationentauscher (DPX-CX), schwache Anionentauscher (DPX-WAX) oder Festphasen zur Aufreinigung so genannter QuEChERS-Extrakte.
Zur Bestimmung von Wirkstoffen und deren Metaboliten aus Arzneimittelrückständen sind GC/MS oder HPLC-MS/MS im Allgemeinen die bevorzugten Techniken. Der Vorteil bei der LC-MS/MS ist, dass sich eine Derivatisierung der Analyten erübrigt, sodass die Probenvorbereitung vereinfacht wird und weniger Zeit raubt. Hinzu kommt, dass die hocheffiziente Ionisierung, kombiniert mit der Tandem-Massenspektrometrie, zu höherer Sensitivität und Selektivität führt. Im Mittelpunkt dieser Untersuchung stand die automatisierte Extraktion geringer Probenvolumina für die LC-MS/MS, um für einen hohen Analysendurchsatz zu sorgen („one sample at a time“). Die Gesamtdauer der Analyse konnte verkürzt beziehungsweise die Produktivität erhöht werden, weil sich Probenvorbereitung und Analyse der vorherigen Probe miteinander zeitlich verschachteln ließen.

Experimenteller Teil

Ausstattung

Die Trennung der Analyten erfolgte auf einem HPLC 1200, ihre Detektion auf einem Triple-Quadrupol- Massenspektrometer 6410 mit ESI-Quelle (beide Geräte von Agilent Technologies). Für die Probenvorbereitung und die Probenaufgabe wurde der MultiPurposeSampler (MPS XL) von GERSTEL verwendet.

Material

Benzodiazepin-Multikomponenten- Mixtur 8 von Cerilliant (enthält acht Komponenten in Acetonitril: Clonazepam, Temazepam, Nitrazepam, Alprazolam, Diazepam, Flunitrazepam, Lorazepam und Oxazepam, 250 μg/mL; enthält acht Komponenten in Methanol: Nordiazepam, Clobazam, Bromazepam, Estazolam, Flurazepam, Midazolam, Triazolam, 1,0 mg/mL, und α-Hydroxyalprazolam, 100 μg/mL). Aus den 16 Benzodiazepinen wurde eine wässrige Stammlösung bereitet, aus der eine Verdünnungsreihe hergestellt wurde. Deuterierte Benzodiazepin-Analoga (d5-Nordiazepam, d5-α-Hydroxyalprazolam, d5-Oxazepam, d4-Clonazepam und d5-Estazolam, jedes in Methanol, 100 μg/mL) wurden von Cerilliant bezogen.

Extraktion

Ein MultiPurposeSampler (MPS) von GERSTEL wurde zur Extraktion des hydrolysierten Urins mit 1-mL-DPX-CX-Pipettenspitzen bestückt. Folgende Methode zur Automatisierung kam zur Anwendung: 250 μL eines 30-prozentigen Acetonitril- Wasser-Gemischs wurden langsam (Fließgeschwindigkeit: 50 μL/s) durch die DPX-Pipettenspitze geleitet, um das Sorbens zu befeuchten. Die Probe wurde dann in die DPX-Pipettenspitze gesaugt und mit dem Sorbens vermischt; dazu wurden 1,3 mL Luft eingezogen. Die Äquilibrierung dauerte 20 Sekunden, anschließend wurde die Lösung entfernt. Zum Auswaschen von Matrixbestandteilen wurde das Sorbensmaterial durch die DPX-Pipettenspitze mit 500 μL einer 10-prozentigen Acetonitril-Wasser-Waschlösung gespült. Es folgte ein zusätzlicher Waschschritt unter Verwendung 100-prozentigen Acetonitrils. Die Elution der Analyten erfolgte mit 700 μL einer Methylenchlorid-Iso-propanol-Ammoniumhydroxid-Lösung [78/20/2 (v/v)], die in die DPX-Pipettenspitze aufgezogen wurde. Das Eluat wurde unmittelbar in saubere 2-mL-Vials pipettiert, dann bis zur Trockenen eingedampft und mittels Zugabe von 50 μL Wasser wieder in Lösung gebracht.

 

Ergebnis und Diskussion

Die DPX-CX-Extraktionen ließen sich mit dem MultiPurposeSampler (MPS) rasch und leicht durchführen. Weil ein basischer Eluent zur Elution der Analyten vom Kationentauscher verwendet wurde, war es erforderlich, vor der HPLC-Trennung das Lösemittel zu wechseln. Mit Blick auf die weltweite Verknappung von Acetonitril wurde eine Alternative als organischer Zusatz zur mobilen HPLC-Phase gesucht und im zehnprozentigen Isopropanol gefunden. Sämtliche HPLC-MS-Spektren wurden mittels MRM (Dynamic Multiple Reaction Monitoring) erfasst, was eine hohe Sensitivität bei der Analyse niedriger Arzneimittelkonzentrationen gewährleistet. Die gewählte Säule garantierte eine rasche Trennung der Analyten innerhalb von zehn Minuten.

Chromatogramme (EIC) einer Urinprobe, versetzt mit 7,5 ng/mL einer Standard-Lösung, nach DPX.

Schlussfolgerung

Die automatisierte DPX-Extraktion von Benzodiazepinen aus Urin gelang erfolgreich mit dem MPS. In der hier vorgestellten Untersuchung betrug die Extraktionszeit insgesamt 6,5 Minuten. Die Probenaufbereitung nahm insgesamt weniger Zeit in Anspruch als der chromatographische Probendurchlauf; von daher kann die nächste Probe bereits bearbeitet werden, während die Analyse der laufenden Probe noch im Gange ist. Jedesmal wenn das LC-MS/MS-System einen Durchlauf beendet hat, steht die nächste Probe schon zur Aufgabe bereit; somit ist ein höchstmöglicher Probendurchsatz gewährleistet. Überdies stellt die Probenvorbereitung just in time sicher, dass die Probe vor Beginn der Analyse nicht zu lange im Autosampler verweilt. Bei der Bestimmung von Benzodiazepinen in Urin wurden mithilfe der DPX-LC-MS/MS-Methode niedrige Nachweisgrenzen für sämtliche Benzodiazepine erreicht. Die Kalibriergeraden wiesen eine gute Linearität auf (R2 ≥ 0,98); die Bestimmungsgrenze lag bei 0,5 ng/mL. Die Methode erwies sich als richtig und präzise. Die durchschnittliche Standardabweichung (RSD) für die analysierten Benzodiazipine lag bei 5,5 % (Bereich: 1,01-26,4 %).

 

 

 

 
 Komponente   QC1 QC2 QC3
    7,5ng/mL 30ng/mL 75ng/mL
 α-OH-Alprazolam Mittelwert 7,50 29,8 78,7
  %RSD 4,30 1,40 2,31
  %Accuracy 101 99,3 105
  N 6 5 6
 Estazolam Mittelwert 7,31 30,5 80,6
  %RSD 1,52 1,01 1,55
  %Accuracy 99,3 102 108
  N 6 5 6
 Lorazepam Mittelwert 6,04 29,5 91,4
  %RSD 8,97 8,48 11,5
  %Accuracy 89,3 98,3 122
  N 6 5 6
 Oxazepam Mittelwert 7,21 30,3 79,6
  %RSD 1,74 1,68 1,22
  %Accuracy 98,6 101 106
  N 6 5 6
 Temazepam Mittelwert 6,97 30,3 78,5
  %RSD 1,96 2,29 1,72
  %Accuracy 97,2 101 105
  N 6 5 6
 Alprazolam Mittelwert 6,65 29,4 86,8
  %RSD 5,03 4,25 3,24
  %Accuracy 93,7 97,9 116
  N 6 5 6
 Clobazam Mittelwert 7,54 31,6 66,4
  %RSD 13,7 5,67 15,3
  %Accuracy 101 105 88,5
  N 6 5 6
 Clonazepam Mittelwert 7,30 29,3 79,0
  %RSD 1,91 2,05 1,75
  %Accuracy 97,7 97,5 105
  N 6 5 6
 
 Komponente   QC1 QC2 QC3
    7,5ng/mL 30ng/mL 75ng/mL
 Diazepam Mittelwert 6,96 30,1 83,7
  %RSD 3,67 3,95 2,19
  %Accuracy 97,7 100 112
  N 6 5 6
 Flunitrazepam Mittelwert 7,33 29,9 80,4
  %RSD 1,67 2,85 1,36
  %Accuracy 98,5 100 107
  N 6 5 6
 Flurazepam Mittelwert 6,15 27,8 89,0
  %RSD 9,96 10,3 5,25
  %Accuracy 86,6 92,5 119
  N 6 5 6
 Midazolam Mittelwert 6,02 27,7 87,9
  %RSD 9,12 9,37 7,40
  %Accuracy 84,9 92,4 117
  N 6 5 6
 Nitrazepam Mittelwert 7,15 29,5 80,2
  %RSD 2,17 4,59 1,44
  %Accuracy 97,6 98,4 107
  N 6 5 6
 Nordiazepam Mittelwert 7,38 29,3 77,8
  %RSD 2,63 2,10 1,77
  %Accuracy 99,5 97,8 104
  N 6 5 6
 Triazolam Mittelwert 6,13 27,0 81,7
  %RSD 6,46 3,69 9,79
  %Accuracy 86,7 89,9 109
  N 6 5 6
 Bromazepam Mittelwert 8,20 31,0 102,0
  %RSD 14,8 15,5 26,4
  %Accuracy 104 103 136
  N 6 5 6

Statistische Auswertung der Bestimmung von Benzodiazepinen in Urin.

Einfluss der Matrix auf die Ionisierung von Benzodiazepinen in hydrolysiertem Urin und Vollblut im Vergleich zu den Standard-Lösungen, angesetzt in reinem Wasser (100 %).