DPX process scheme
Der DPX-Prozess
Sofern erforderlich, lässt sich das Sorbens in der Pipette mit einem Lösemittel vor der Extraktion konditionieren. Sämtliche Schritte der DPX verlaufen auf dem MPS-Autosampler automatisiert:
1 Die Probe wird aus der Vorlage in die Pipettenspitze gezogen, ohne mit der Nadel der Mikroliterspritze in Berührung zu kommen.
2 Durch Ansaugen von Luft werden Probe und Sorbens optimal gemischt, mit dem Resultat einer effizienten Extraktion mit hoher Ausbeute.
3 Nach 30 bis 90 Sekunden ist die Extraktion erfolgreich beendet; die Probenflüssigkeit wird aus der Spitze entleert. Bei Bedarf lässt sich ein Waschschritt einfügen.
4 Anschließend werden die extrahierten Analyten mittels eines geeigneten Lösemittels eluiert und der Extrakt wird in ein vorbereitetes Vial pipettiert.
Die Extraktion einer Probe dauert maximal sechs Minuten. Probenvorbereitung und Analyse verlaufen zeitlich verschachtelt.
TIC and EIC of whole blood samples spiked with drugs of abuse
Drogenwirkstoff  RSD
Amphetamin 13.9 %
Methamphetamin 14.4 %
Meperidin 5.8 %
PCP 2.2 %
Methadon 3.3 %
Methaqualon 3.6 %
Amitriptylin 3.1 %
Kokain 3.8 %
cis-Doxepin 2.8 %
Imipramin 3.3 %
trans-Doxepin 3.2 %
Pentazocin 5.3 %
Codein 4.2 %
Desipramin 6.4 %
Drogen in Blut: Totalionen-Chromatogramm (TIC) und die Ionenspuren (EIC) eines DPX-Extrakts von 250 µL Vollblut, versetzt mit 0,5 ppm einer Mischung gängiger Drogenwirkstoffe:
1) Meperidin, ­2) Interner Standard d5-PCP (Ion 205), 3) PCP,
4) Methadon, 5) Metha­qualon,
6) Amitriptylin, 7) Kokain,
8) cis-Doxepin 9) Imipramin,
10) trans-Doxepin, 11) Desipramin, 12) Pentazocin, 13) Codein.

Analysenbedingungen

KAS: 1 min Lösemittelausblendung (150 mL/min); splitlos; Temperaturprogramm: 80 °C (1 min) – 12 °C/min – 300 °C (3 min)
Säule: 30 m HP5 (Agilent Technologies); di = 0,25 mm; df = 0,25 µm
Pneumatik:    He, konstanter Fluss, 1,5 mL/min
GC-Ofen: 100 °C (0,5 min) – 20 °C/min – 300 °C (12,5 min)
MSD: Selectable-Full-Scan- oder SIM-Modus
Cannabis: TIC von 10 ng/mL THC und seiner Metaboliten, extrahiert aus dem Überstand von  0,5 mL Vollblut nach Fällung der enthaltenen Proteine und  Zentrifugieren:
1) THC-TMS, 2) OH-THC-TMS, 3) COOH-THC-2TMS.
Benzodiazepine in Urin: TIC von 0,2 ppm Benzodiazepinen
in 0,2 mL Urin nach enzymatischer Hydrolyse, DPX und Derivatisierung:
1) Diazepam, 2) Nordiazepam-d5-TBDMS, 3) Nordiazepam-TBDMS, 4) Flunitrazepam, 5) 7-Aminoflunitrazepam
6) Oxazepam-2 TBDMS, 7) Temazepam-TBDMS, 8) Nitrazepam,
9) Lorazepam-2-TBDMS, 10) Clonazepam-TBDMS,
11) Alprazolam, 12) α-OH-Alprazolam-d5-TBDMS,
13) α-OH-Alprazolam-TBDMS

Forensische Toxikologie

Drogenrückstände im Nu extrahieren

Die forensisch-toxikologische Untersuchung von Körperflüssigkeiten setzt in der Regel eine aufwändige Probenvorbereitung voraus. GERSTEL präsentiert mit der Automatisierung der Disposable Pipette Extraction (DPX) eine neuartige Extraktionstechnik, die auf dem Einsatz mit losem Sorbensmaterial gefüllter Einwegpipettenspitzen basiert und den Arbeitsablauf effizienter gestaltet, vereinfacht und verkürzt.

Körperflüssigkeiten stellen eine überaus komplexe Matrix dar. Um Drogen- und Medikamentenrückstände in Blut und Urin sicher und quantitativ zu bestimmen, bedarf es eines geeigneten chromatographischen Verfahrens sowie einer adäquaten Probenvorbereitung. Mitunter sind mehrere Extraktionstechniken vonnöten, soll die Analyse erfolgreich durchgeführt werden. Zu den gängigsten Extraktionstechniken in forensisch-toxikologischen Laboratorien gehört die Festphasenextraktion (SPE). 
Die traditionelle Vorgehensweise der SPE sieht den Einsatz größerer Mengen teils toxischer Lösemittel vor, die verdampft werden müssen, nicht selten nach mehreren zeitaufwändigen manuellen Arbeitsschritten, um die Analyten anzureichern und die geforderten Detektionsgrenzen zu erreichen. Schließt die chemische Natur der Analyten ihre Trennung mittels der Gaschromatographie aus, bleibt als Hintertür nur die Derivatisierung. Das Klagen der Anwender lässt sich nachempfinden, weil die arbeits- und zeitintensive Probenvorbereitung als „Flaschenhals“ der Analyse den Probendurchsatz und auch den Bewegungsspielraum des Laborpersonals limitiert.
Dass es effizienter und schneller geht, also ohne aufwändige manuelle Arbeitsschritte, gleichzeitig sicher und zuverlässig, mit nur einem Bruchteil der bisher üblichen Lösemittel- und Probenmenge, zeigt die neuartige Disposable Pipette Extraction (DPX) von DPX Labs. Inhaber der Firma und Erfinder der DPX-Technik ist Professor William E. Brewer von der University of South Carolina. Automatisiert wurde die DPX von GERSTEL. Das Unternehmen aus Mülheim an der Ruhr zählt zu den weltweit führenden Experten in der Automatisierung der Probenvorbereitung und Probenaufgabe in der Gas- und Flüssigchromatographie. GERSTEL präsentierte die automatisierte DPX auf der PittCon 2009 in Chicago, USA, erstmals einem größeren Fachpublikum. Erste Berührungspunkte mit Anwendern gab es allerdings schon im Oktober 2008 auf der Konferenz der Society of Forensic Toxicologists (SOFT) in Phoenix, Arizona (USA). „Die Reaktionen der Experten lassen den Schluss zu, dass wir mit der DPX eine viel versprechende Alternative zu den bislang gängigen Extraktionstechniken in den US-amerikanischen Markt eingeführt haben“, resümiert Dr. Robert Collins, Direktor der GERSTEL Inc. in Baltimore, Maryland (USA).
Mit dem Ziel, die Effizienz der GC/MS-Analyse von Drogen und deren Metaboliten in Blut und Urin zu steigern, griffen die Applikationschemiker von GERSTEL auf die DPX-Technologie zurück. Die Applikation machte es erforderlich, jede einzelne Probe zeitnah zur Analyse zu präparieren: Die Probenaufgabe habe just in dem Moment zu erfolgen, wenn das GC/MS-System nach Abschluss eines GC-Laufs wieder bereit für die Aufgabe der Probe ist, beschreibt Dr. Collins.
Probenvorbereitung und Probenaufgabe zeitlich derart zu verschachteln, sei immer dann sinnvoll, wenn es darum gehe, Zeit und Gerätelaufzeiten zu optimieren oder wenn es sich um labile Proben handle und die Gefahr von Substanzverlust durch Umwelteinflüsse oder Abbaureaktionen bestehe, „was insbesondere nach der Derivatisierung nicht per se auszuschließen ist“, betont der Geschäftsführer. Dank MAESTRO-Steuersoftware mit PrepAhead-Funktion ließ sich das Vorhaben der Verschachtelung von Probenvorbereitung und -aufgabe leicht in die Tat umsetzen.

Von der Theorie zur Praxis

Um ihr MPS-DPX-KAS-GC/MS-System in der Praxis zu testen, dotierten und analysierten die GERSTEL-Experten Blut- und Urinproben mit unterschiedlichen Drogenwirkstoffen und Medikamenten. Die Bandbreite der untersuchten Stoffe erstreckte sich von Amphetaminen und Benzodiazepinen über Kokain und Methadon bis Tetrahydrocannabinol und seine Metaboliten (Details siehe Abbildungen). Die Analyse erfolgte unter Einsatz deuterierter interner Standards: Für die Blutproben wurde d5-PCP (0,2 ppm) eingesetzt, für die Bestimmung von Benzodiazepinen kamen d5-Nordiazepam (0,2 ppm) und d5-OH-Alprazolam (0,2 ppm) zum Einsatz und für die Opiate verwendete man die deuterierte analoge Verbindung (jeweils 0,1 ppm).

Erforderliche manuelle ­Probenvorbereitungsschritte

Aufbereitung der Blutproben: 0,25 mL einer Vollblutprobe wurden zum Ausfällen der Proteine mit 0,5 mL Acetonitril versetzt und gemixt. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand in saubere und etikettierte Röhrchen überführt, von denen jedes 0,1 mL einer 0,1 M Salzsäure (HCl) enthielt.
Aufbereitung der Urinproben für die Bestimmung von Benzodiazepinen: Um Drogen- und Medikamentenrückstände in Urin nachweisen zu können, bedarf es teils einer Hydrolyse der jeweiligen Konjugate. „Dieser Schritt ist nicht für alle Zielsubstanzen zwingend gewesen“, sagt Dr. Oliver Lerch, Applikationsexperte bei GERSTEL. Eingeleitet wurde die Hydrolyse-Reaktion durch Zugabe von 10 µL der wässrigen Lösung des Enzyms b-Glucuronidase und 50 µL 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 4 in je 0,2 mL Urinproben. Sie wurden dann für die Dauer von zwei Stunden auf
55 °C gehalten, auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Ausfällung des Enzyms mit 0,25 mL Acetonitril versetzt. Die Lösung wurde zentrifugiert und der Überstand in saubere und etikettierte Probenröhrchen überführt.  Nachdem jede Probe mit 200 µL einer 0,1 M Salzsäure versetzt worden war, wurden die Vials in das Probentray des MPS 2 gestellt.

Automatisierte DisposablePipetteExtraction (DPX)

Die DPX, automatisiert auf dem Multi­PurposeSampler (MPS), schloss sich an. Verwendet wurden so genannte 1-mL-DPX-CX-Spitzen von DPX Labs. Die Terminologie erlaubt Rückschlüsse auf das vorliegende Sorbensmaterial bzw. dessen Eigenschaften: DPX-CX-Spitzen enthalten als Sorbens einen Kationenaustauscher, der obendrein gewisse unpolare Eigenschaften besitzt. 
Das Prozedere verlief vollständig automatisiert: 250 µL einer 30%igen Acetonitril-Wasser-Lösung wurden auf das DPX-Sorbens gegeben. Die DPX-Spitze tauchte in die Probenlösung, eine definierte Menge Probeflüssigkeit wurde aufgezogen. Mittels eingezogener Luft wurde die Probe mit dem Sorbens gut durchmischt. Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, in der sich die Analyten auf dem Sorbens angereichert und ein stabiles Gleichgewicht erreicht hatten, wurde die Probenlösung entfernt und das Sorbens erst mit 0,5 mL der 30%igen Acetonitril-Wasser-Lösung, dann mit 0,5 mL reinem Acetonitril gewaschen. Beide Waschlösungen wurden jeweils in den Abfallbehälter entleert. Die Elution der Analyten erfolgte unter Einsatz von 0,7 mL einer Lösung aus 2 % NH4OH, 78 % CH2Cl2 ­und ­
20 %­ Isopropanol direkt in vorher gekennzeichnete GC-Vials. „Die Gesamtzeit für Extraktion und Flüssigkeitshandling betrug je Probe nur sechs Minuten“, berichtet Dr. Lerch.

Instrumentierung

Die Analysen erfolgten auf einem GC/MS-System 6890N/5975 (inert XL) von Agilent Technologies. Der GC war mit einem KAS ausgestattet. Zur automatisierten Probenvorbereitung und Probenaufgabe kam eine MPS-PrepStation mit DPX-Option und MAESTRO-Softwaresteuerung zum Einsatz. Steuern ließ sich das Komplettsystem komfortabel mittels einer integrierten Methode und einer integrierten Sequenztabelle aus der ChemStation von Agilent Technologies. Die MAESTRO-Steuersoftware von GERSTEL war darin eingebunden.

Derivatisierung

Manche Analyten erfordern eine Derivatisierung vor der GC-Analyse. „Das KaltAufgabeSystem (KAS) bietet eine inerte und temperierbare Umgebung“, schildert Prof. Brewer, „die sich eignet, überschüssiges Lösemittel zu verdampfen und gleichfalls die Derivatisierung der Analyten vorzunehmen.“ Zur Derivatisierung der Benzodiazepine wurden 20 µL ­50 %­ N-(t-butyldimethylsilyl)-N-methyl-­trifluoracetamid (MTBSTFA) in Acetonitril in die Injektionsspritze gesaugt, gefolgt von 20 µL Luft und von 50 µL des Eluats aus der automatisierten DPX-Probenvorbereitung. „Die resultierende Sandwich-Injektion erfolgte zeitverzögert in einem programmierten Stop-flow-Verfahren, um sicherzustellen, dass das Lösemittel vor der Injektion des Derivatisierungsreagens sicher und vollständig durch den Splitausgang entfernt wurde“, erklärt der Applikationsexperte. Die Temperatur wurde rasch auf 300 °C hochgefahren, wobei die Analyten derivatisiert und im Splitless-Modus auf die GC-Säule überführt wurden.
„Die automatisierte Derivatisierung im GC-Eingang erwies sich als praktisch und komfortabel“, berichtet Prof. Brewer. Sie war erfolgreich für verschiedene Benzodiazepine in Blut. Andere Analyten ließen sich mit dieser Methode jedoch nicht so einfach derivatisieren, sie wurden deshalb im Probenvial derivatisiert. Das Eluat aus der DPX-Extraktion wurde dazu in klassischer Weise unter Stickstoff bis zur Trockene eingedampft, mit 50 µL MTBSTFA oder BSTFA sowie 50 µL Ethylacetat versetzt und für die Dauer von 20 Minuten auf 70 °C gehalten. Nach der Abkühlung wurde jede Lösung mittels LVI direkt in das Inlet des GCs injiziert (50 µL).

Das Fazit des Experten

„Die Messung mit der automatisierten DPX lieferte wie erwartet überdurchschnittlich gute Ergebnisse“, fasst Robert Collins die Ergebnisse zusammen. Ob­-gleich sämtliche Analysen mit einem Probenvolumen von 0,25 mL (Vollblut) beziehungsweise 0,2 mL (Urin) durchgeführt wurden, war die resultierende Peak­intensität sehr zufriedenstellend – auch wenn die Detektion im Full-scan-Modus erfolgte. Alles in allem ließe sich nach der durchgeführten Untersuchung feststellen, dass die auf dem MultiPurpose­Sampler (MPS) automatisierte DPX-Technik eine schnelle Probenvorbereitung ermögliche. Am Rande bemerkt, führe die automatisierte DPX einschließlich aller weiteren Probenvorbereitungsschritte beim Arbeiten mit der GERSTEL-­DualRail-MPS-PrepStation zum größtmöglichen Probendurchsatz. Diese Gerätekombination habe sich insbesondere bei der Bestimmung von zahlreichen basischen Drogen wie Kokain, Methadon, PCP, TCAs und Meperidin bewährt. Die meisten Benzodiazepine ließen sich gut bestimmen, wenn die Derivatisierung mit MTBSTFA im GC-Eingang erfolgte. Unter Beobachtung standen: Diazepam, Nordiazepam, Oxazepam, Temazepam, Alprazolam und a-OH-Alprazolam. „In Kombination mit der GC/MS brachte die DPX hervorragende Ergebnisse für die Bestimmung von elf Benzodiazepinen in Urin“, betont Robert Collins. Hohe Wiederfindung und auch hohe Empfindlichkeit zeigten sich bei der Bestimmung von Opiaten; für die meisten davon lagen die Nachweisgrenzen unter 1 ng/mL in Vollblut.