Autoren

Thomas Grimm,
BIOWORX, 12489 Berlin

Dr. Eike Kleine-Benne,
GERSTEL GmbH & Co. KG,
45473 Mülheim an der Ruhr

Prof. Dr. R. Senz,
Technische Fachhochschule Berlin,
13353 Berlin

Dr. C. Piechotta,
Bundesanstalt für Materialforschung
und -prüfung (BAM), 12205 Berlin

Weitere Informationen:
BIOWORX, Volmerstr. 7B, 12489 Berlin
Tel. +49 (0)30 63921041

E-Mail: info@bioworx.de, www.bioworx.de

  Empfohlener Füllstand Geeignet für Substanzgruppe
Messart 10-mL-Vials 20-mL-Vials  
Headspace 2-6 mL  5-15 mL  Substanzen mit niedrigem Siedepunkt und hohem Dampfdruck
SPME-Headspace 2-5 mL  5-10 mL  Breites Spektrum in der Gasphase nachweisbarer Substanzen
SPME-Flüssigkeit 5-10 mL  15-20 mL  Hydrophile Substanzen mit hohem Siedepunkt, die kaum noch in der Gasphase nachzuweisen sind.
Tabelle 1: Ermittelte Kennwerte für 10- und 20-mL-Headspace-Vials mit verschiedenen Substanzen.
Automatisierte SPME-HS-Probenaufgabe mit dem GERSTEL-MPS-Bioscreen. Durch den Einsatz der SPME-Headspace-Analytik wird die Sensitivität um das 480-Fache erhöht
Abbildung 1: SPME Messungen der mikrobiellen Umsetzung von Acetophenon (AP) 0,25% / 0,5% als Funktion der Inkubationszeit.
Abbildung 2: Adsorption der Analyten an der SPME-Faser als Funktion der Inkubationszeit.
Abbildung 3: Wiederholbarkeit der SPME Messung mit verschiedenen Edukten/Produkten (Substanzen 50:50 Standard).
Abbildung 4: Kalibriergeraden von Acetophenon und Phenylethanol mit SPME-Faser (Polyacrylate).
Abbildung 5: Reproduzierbarkeit der Reduktion von 4-Hydroxy-2-butanon zu 1,3-Butandiol im Maßstabsvergleich.
Abbildung 6: Untersuchung von Hefen auf Acetophenon-Reduktion im Screeningsystem mit HS-SPME.

Biochemie / Biotechnologie

Metabolismus in Flaschen

Längst haben die Gas- und Hochleistungs-Flüssigchromatographie ihren Platz auch in der Biotechnologie gefunden. Mithilfe von GC und HPLC lassen sich in Verbindung mit der SPME-Headspace-Technik enzymatische Reaktionen sowie Stoffwechselprozesse einfach überwachen und exakt nachvollziehen und dies im Minimaßstab: in klassischen Headspace-Vials. Um diesen Prozess effizient und sicher automatisiert durchführen zu können, haben Wissenschaftler und Anwender in Zusammenarbeit mit GERSTEL-Experten den MPS-Bioscreen entwickelt.

Im Verlauf enzymatischer und mikrobieller Reaktionen werden Ausgangsstoffe mithilfe von Biokatalysatoren wie Enzymen, Mikroorganismen, pflanzlichen oder tierischen Zellen in Substanzen definierter chemischer Zusammensetzung umgewandelt. Gerade mikrobielle Reaktionen verlangen gleichbleibende, definierte Bedingungen insbesondere in puncto Temperatur und pH-Wert. Zur Detektion und Auswertung des Stoffwechsels bedarf es einer Analysentechnik, die den spezifischen Bedingungen Rechnung trägt. Dies gelingt mit der GC- beziehungsweise HPLC; beide Trenntechniken haben sich in der bioanalytischen Praxis bewährt. Mit chiralen Trennsäulen lassen sich nicht nur die biologischen Reaktionsprodukte von den Ausgangsstoffen abtrennen, auch die Enantiomerenreinheit der Produkte kann direkt bestimmt werden. Allerdings ermöglichte es bisher kein verfügbares System, die Biotansformation mit nachfolgender GC- beziehungsweise HPLC-Analyse komplett automatisiert durchzuführen. Im Rahmen eines Forschungs- und Entwicklungsvorhabens hat die in Berlin ansässige Firma BIOWORX in Zusammenarbeit mit GERSTEL und erfahrenen Anwendern das GERSTEL-MPS- Bioscreen entwickelt. Hierbei handelt es sich um ein leistungsfähiges System für das Screening biologischer Anwendungen unter Einsatz der SolidPhaseMicroExtraction (SPME) in Verbindung mit der Headspace-Technik (HS). In kleinen Testansätzen lassen sich eine große Anzahl unterschiedlicher biochemischer Vorgänge untersuchen und schnell Ergebnisse über deren Umsetzung voll automatisiert produzieren.

Am Anfang stand für die Autoren des nachfolgenden Beitrags die Herausforderung und die Suche nach Antworten: „Das Reaktionssystem sollte über ein Reaktionsgefäß verfügen, das sterilisier- und verschließbar ist. Es sollte von einer Größe sein, die eine Einpassung in gängige Autosampler, eine möglichst effiziente Handhabung sowie einen hohen Probendurchsatz möglich macht. Die Probe wiederum sollte sich für ein homogenes aerobes mikrobielles Wachstum gut durchmischen und sowohl luftdicht als auch luftdurchlässig verschließen lassen.“

Wie sich im Verlauf zeigte, ermöglicht es die GC, die Reaktionskinetik laufender biologischer Prozesse einfach zu überwachen und zu analysieren, und zwar in GCHeadspace- Vials (HS-Vials). Es stellte sich auch heraus, dass es durch Modifikation des Vialdeckels gelingt, aerobe und anaerobe biologische Prozesse zu etablieren und reproduzierbare Reaktionen mit einem Volumen von 1 bis 15 mL zu realisieren. Um nun das Prozedere nebst Chromatographie und Detektion möglichst automatisiert durchführen zu können, musste ein Autosampler zum Einsatz kommen, der sich entsprechend flexibel einsetzen lässt. Verwendet wurde der GERSTEL-Multi- PurposeSampler (MPS), ein XYZ-Laborroboter für die GC und LC, der seine Bewegungen frei programmierbar in alle drei Raumrichtungen ausführt. Und um die biotechnologische beziehungsweise bioanalytische Aufgabe erfüllen zu können, wurde der MPS mit einem Magnetrührer ausgestattet. Mit diesem Magnetrührer ist es möglich, die Vials im Bereich von 10 bis 120 °C zu temperieren.

Verbesserte Probenvorbereitung fördert den Erfolg

Durch Wahl der idealen Durchmischungsart und -geschwindigkeit lässt sich die Probenvorbereitung nach individuellen Erfordernissen erheblich verbessern. Die HS-Vials eignen sich zur Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen. Verschließen lassen sich die Vials mit verschraubbaren Kappen aus Edelstahl, die erforderliche Modifikationen zulassen; für anaerobe Untersuchungen wurde ein Membranverschluss, für aerobe Versuche und aerobes Zellwachstum ein gasdurchlässiger Verschluss (poröses Silikon) verwendet. Die Vials sind mit und ohne Medium im Dampfsterilisator bei 121 °C sterilisierbar.

In Zusammenarbeit mit der TFH Berlin wurde untersucht, inwieweit sich 10- beziehungsweise 20-mL-SPME- und -HS-Vials für Biotransformationssysteme eignen. Systematisch wurden die jeweiligen Füllstände optimiert und geeignete Messarten für die verschiedenen Substanzgruppen ermittelt (siehe Tab. 1). Eine weitere Frage war, wie sich die Analyse relevanter biologisch aktiver Substanzen auf das Biotransformationssystem übertragen lässt. Die Untersuchung ergab eine gute Reproduzierbarkeit der Messwerte.

Weil die SPME-HS-Analytik deutlich sensitiver ist als die herkömmliche Headspace-Technik, konnten auch geringere Konzentrationen problemlos nachgewiesen werden. Einen Beleg liefert die Messung der mikrobiellen Umsetzung von Acetophenon zu Phenylethanol: Es ergab sich bei Acetophenon ein 85-fach stärkeres Signal. Bei Phenylethanol wurde sogar ein um das 480-Fache stärkeres Signal gemessen, was sich durch den Einsatz eines für Alkohole selektiven SPME-Materials erreichen ließ. Deutlich wurde gezeigt, wie wichtig es ist, die SPME-HS- Methode an die jeweiligen, analytbezogenen Anforderung anzupassen. Unter anderem erweist es sich als überaus schonend für die eingesetzte SPME-Faser – nicht nur in der hier beschriebenen Methode –, wenn die Probe nicht geschüttelt, sondern gerührt wird.

Im weiteren Verlauf wurden unterschiedliche Biotransformationen mit direktem SPME-HS-Monitoring durchgeführt. Mithilfe der Kalibriergeraden konnte aus den gemessenen Peakflächen der jeweilige Umsatz berechnet werden. Das Gasphasengleichgewicht stellte sich problemlos ein, wie die Umsetzung von Acetophenon zu Phenylethanol in zwei verschiedenen Konzentrationen zeigt (siehe Abb. 1). Die Messung erfolgte in beiden Versuchen mittels SPME-HS aus dem Dampfraum (Headspace). Es ergab sich eine glatt und gleichmäßig verlaufende Umsatzkurve; der 0,25%ige Ansatz wurde zu 90 Prozent, der 0,5%ige Ansatz zur Hälfte durch Mikroorganismen umgesetzt. Auch bei der Biotransformation anderer Substanzen wie 2-Octanon hat sich das SPME-HS-Monitoring bewährt, wie reproduzierbar gute Ergebnisse deutlich machen.

Um die Kinetik der SPME-Adsorption während des Messvorgangs zu charakterisieren, wurden mit unterschiedlichen SPME-Materialien Sättigungskurven für Standardsubstanzen aufgezeichnet. Das Prozedere sah vor, die Inkubationsdauer der SPME-Faser im Gasraum des Vials kontinuierlich zu erhöhen, bis die Größe der gemessenen Peakfläche nicht mehr proportional steigt bzw. sogar stagniert. Ein Beispiel einer solchen Messreihe zeigt die Abbildung 2 für Acetophenon und Phenylethanol. Zu erkennen ist die schnelle Sättigung der Faser mit Acetophenon, wohingegen die Phenylethanol-Peakflächen selbst bei einer Inkubationsdauer von 15 Minuten noch keinen konstanten Wert erreichen. Bei steigender Inkubationszeit verschiebt sich das Gleichgewicht der Anreicherung von Phenylethanol aus dem Gasraum Richtung Faser. Wichtig ist daher die exakt eingehaltene Inkubationszeit der SPME-Faser.

Um die Reproduzierbarkeit der SPME-Messungen zu überprüfen, sind Standardansätze mit Analytmischungen mehrfach vermessen worden; für die Ergebnisse wurden die Standardabweichung und der prozentuale Fehler berechnet. In Abbildung 3 sind Mittelwerte und zugehörige Abweichungen für zwei typische Edukt/Produkt-Gemische dargestellt. Bei gleicher Standardabweichung fällt der Fehler bei kleineren Messwerten stärker ins Gewicht, trotzdem sind die Fehler gering und die Richtigkeit und Wiederholbarkeit für die Zwecke eines Screening-Systems gut.

Für die verwendeten Testsubstanzen wurden mit dem SPME-Messsystem Kalibriergeraden erstellt und die Wiederholbarkeit getestet. Mit der Kalibriergeraden konnten die im Screening-Versuch bestimmten Werte in Stoffumsetzungen umgerechnet werden (siehe Abb. 4), etwa für die Umsetzung von Acetophenon zu Phenylethanol. Es zeigt sich über den Messverlauf eine gute Linearität (Korrelation über 0,995) und Reproduzierbarkeit. Die Messung wurde bei einer Inkubationszeit der SPME-Faser in der Gasphase von zehn Minuten erstellt. Allerdings ist es bei höheren Konzentrationen der Substanzen sinnvoll, kürzere Inkubationszeiten zu wählen. Versuche mit zwei und fünf Minuten Inkubationszeit brachten ebenfalls eine gute Wiederholbarkeit.

Maßstabsübertragbarkeit

In der entwickelten SPME-HS-GC-Reaktions- und Analyseneinheit wurden verschiedene Reihen von Biotransformationen durchgeführt, analysiert und ausgewertet, um die Umsetzung bestimmter Substanzen mit verschiedenen Biokatalysatoren überwachen und verbessern zu können. Aufgrund der vergleichbar kleinen Versuchsanordnung konnte bereits aus einer geringen Menge an Mikroorganismen und Testsubstanzen eine Vielzahl von Ansätzen erstellt und untersucht werden. Die GC mit chiraler Trennsäule ermöglichte eine schnelle Auswertung der Messergebnisse. Die Untersuchung von miniaturisierten Ansätzen parallel zu Batch- Ansätzen mit 200 bis 2000 mL brachte einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen Ansatzgrößen. Wichtige Faktoren für eine gute Maßstabsübertragung sind: identische Temperaturen, eine vergleichbare Belüftung und übertragbare Volumen-Oberflächen- Verhältnisse. Es zeigt sich eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im miniaturisierten System bei einer Maßstabsvergrößerung von fast 1:100 (siehe Abb. 5).

Diese Versuche, u.a. zum Einfluss des pH-Wertes auf die mikrobielle Aktivität, waren wichtig, um die Vorgehensweise allgemein auf andere Versuche übertragen zu können. Ähnliche Versuche wurden zur Temperatur, Belüftung und Eduktkonzentration durchgeführt. Es ergaben sich zwei Parametergruppen: eine Gruppe, die systemunabhängig für jeden Ansatz eingestellt werden kann (z. B. pH, Eduktkonzentration, Zuckerkonzentration, Feeding), und eine Gruppe, die systemabhängig pro Rührsystem (z. B. Temperatur, Belüftung durch Rührerdrehzahl) ist. Die systemabhängigen Parameter sind für die meisten Screening- Systeme typisch, da etwa die Temperatur innerhalb einer Mikrotiterplatte, innerhalb eines Thermoblocks oder innerhalb einer Temperiereinheit nicht variiert werden kann (siehe Abb. 6). 

Ausblick und Perspektiven

Durch die spezielle direkte Stoffdetektion kann neben der Umsatzmenge auch eine Aussage über die Umsetzungsqualität (Substanznachweis, Enantioselektivität, etc.) gemacht werden. Das ist ein wichtiger Vorteil gegenüber üblicherweise verwendeten photometrischen Nachweisen. Die Nachweismethoden lassen sich mit der GC schnell entwickeln und führen so zu einem kurzen Weg von der Produktanfrage zum Produkt. Mit den Erfahrungen dieser Versuchsreihen wurde eine Arbeitsanleitung für das Vorgehen bei der Verwendung des Systems für Screening- und Optimierungsversuche erstellt. Die SPME-HS-GC-Reaktionsund Analyseneinheit basierend auf dem GERSTEL-MPS-Bioscreen ermöglicht eine zeitnahe Entwicklung und Umsetzung von Synthesen. Dank eines raschen Screenings lassen sich in kurzer Zeit bis zu 64 Versuche mit einem breiten Spektrum von Biokatalysatoren parallel durchführen und auswerten.

In der voll automatisierten Ausbaustufe ist eine Versuchsabarbeitung rund um die Uhr möglich. Neben der Entwicklung von Biotransformationen können auch Abbauversuche und Stoffwechselvorgänge untersucht und über GC/MS und LC/MS die entstehenden Abbauprodukte verfolgt werden.